（来源：小麦研究联盟）
随着植物功能基因组学的飞速发展，研究人员已经在主要农作物中鉴定出大量与高产、优质及抗逆性相关的优异等位基因。在现代精准育种中，一个核心目标是将这些分布在不同品种中的优异性状快速聚合到精英品种中。然而，这一过程面临巨大的技术挑战。当前的基因组编辑策略通常需要针对不同的突变类型使用不同的工具，例如：使用Cas9进行基因敲除（KO）、使用碱基编辑器进行单核苷酸替换、以及使用引导编辑（Prime Editing, PE）进行小片段的精准修饰。这种“分而治之”的方法迫使育种家不得不进行多轮迭代编辑，或者在不同品系中平行编辑后再通过耗时的杂交进行聚合，效率极其低下。
此外，传统的Cas9介导的基因敲除依赖于双链断裂（DSB）引发的随机修复，这往往会产生约20%的“框内突变”（in-frame mutations），即突变后的蛋白质仅增减了几个氨基酸但仍保留功能。在处理像小麦这样的多倍体作物时，这种不完全敲除会导致目标性状无法完全显现。因此，开发一种能够在一个系统中同时实现多种类型精准编辑，且能高效、彻底敲除目标的“全能型”编辑工具，对于植物生物技术和作物改良具有重要意义。
中国科学院遗传与发育生物学研究所的高彩霞团队在 Nature Biotechnology发表了题为“Multiplexed, precise genome engineering in monocots with twin prime editing systems”的论文，揭示了一种基于双引导编辑（twin PE）的新型基因组工程系统。该研究首先开发了基于终止密码子集群（SCC）安装的敲除系统（TKO），能够在不依赖DSB修复的情况下实现精准的翻译终止。随后，研究团队通过整合TKO、传统引导编辑及重组酶系统，构建了TRIM1和TRIM2多功能编辑平台。这些系统在水稻、玉米和小麦中表现出极高的精准度和多重编辑能力，不仅显著降低了框内突变的比例，还实现了从单碱基到千碱基尺度的多目标同时修饰，为作物育种提供了一套灵活、高效且可扩展的“全能型”工具箱。
高效TKO编辑器的开发
研究团队最初尝试使用单pegRNA引导编辑系统引入敲除突变（如单碱基插入或终止密码子替换），但在水稻原生质体中的效率均低于4.2%。受双引导编辑（twinPE）替换小片段能力的启发，研究者设计了TKO系统，通过在目标位点精准插入一段短的SCC序列来实现敲除。SCC的设计遵循四大原则：优先使用TAA和TAG以减少读通、包含三个不同框架的终止密码子以确保彻底终止、使用胞嘧啶（C）作为DNA末端以及优化RT模板的二级结构。
在对18种SCC变体进行筛选后，发现SCC11（27 bp）在水稻多个内源基因上的平均精准插入效率高达66.8%（图1b-d）。进一步优化发现，当两个切口（nicks）之间的距离在30–50 bp时，TKO系统的活性达到峰值（图1e）。与单pegRNA策略相比，TKO系统的敲除效率提升了8.1–66.9倍。
TKO在单子叶植物中的高效性与精准性
研究团队在水稻和玉米中对比了TKO与传统Cas9系统的性能。结果显示，TKO在水稻原生质体中的敲除效率最高可达70.5%，平均比Cas9系统高出2倍以上（图2b）。更关键的是，Cas9产生的突变中有约16%为框内突变，可能导致蛋白质功能残余；而TKO系统通过预设的SCC序列强制终止翻译，产生的框内突变极少（图2c）。
在水稻稳定转化实验中，TKO介导的OsKRN2或OsPDS敲除频率高达96.8%。值得注意的是，Cas9产生的OsPDS框内突变（如ΔE229）植株表现出野生型表型，而TKO产生的突变体则表现出完全的白化表型，证明了TKO敲除的彻底性（图2f-h）。由于TKO突变是可预测的，研究者还开发了一种名为DVM的简易分型方法，仅通过凝胶电泳即可直观区分纯合、杂合及野生型植株，显著降低了检测成本。在玉米中，TKO的平均敲除效率也达到了47.8%，比Cas9系统高3.0–8.5倍（图2e）。
小麦多同源基因的高效同时敲除
在六倍体小麦中，同时敲除三个同源基因（A、B、D基因组）是一大难题。研究发现，TKO在小麦原生质体中的同源基因敲除效率高达75.1%（图2f）。通过粒子轰击法转化小麦幼胚，TKO在产生三基因同时敲除突变体方面的频率比Cas9高出4.2倍（图2d）。这主要归功于TKO规避了框内突变，确保了每个同源副本都被彻底破坏。这一突破意味着研究者可以在单次转化中直接获得完全敲除的植株，无需多代杂交聚合。
正交TKO系统实现大规模多基因敲除
为了实现多基因同时敲除而不产生异位重组（跨位点串扰），研究团队开发了正交TKO系统。他们筛选并验证了10个具有序列特异性且互不干扰的正交SCC变体（图3a-e）。利用这一系统，研究者在水稻中实现了多达10个基因的同时敲除。通过优化pegRNA的处理方式（如使用不同的tRNA或HDV核酶），多重编辑频率显著提升。在T0代水稻中，四基因同时敲除的频率比Cas9系统提高了0.2–4.6倍（图3h）。
TRIM1和TRIM2：集成式多功能编辑平台
研究团队最终建立了两个集成平台：
TRIM1系统：将TKO与单/双pegRNA引导编辑整合。在水稻中，使用一个包含23个pegRNA的质粒，TRIM1成功实现了对12个基因的编辑。在稳定转化中，TRIM1在水稻中实现了22.8%的四基因共编辑频率，包括敲除OsKRN2并对另外三个位点进行精准纯合修饰，成功聚合了抗草甘膦、株型紧凑及高产等性状（图4c-e）。
TRIM2系统：将Cre重组酶与PE融合。该系统不仅能完成TRIM1的所有功能，还能通过PE引入重组位点（RS），再利用重组酶介导千碱基尺度的大片段操作。研究证明，TRIM2能在敲除基因的同时，在水稻原生质体中实现4.9 kb大片段的精准插入（效率1.2%）和高达79.8%的基因敲除（图4j）。
全文总结与展望
本研究开发的TKO及TRIM系统标志着农作物基因组工程进入了“多功能、高精准、高效率”的新阶段。TKO编辑器通过精准安装SCC序列，解决了传统Cas9敲除中框内突变导致的“敲除不彻底”难题，特别是在多倍体小麦改良中展现出巨大优势。TRIM系列平台则首次在单子叶植物中实现了从单点精准修饰到大规模染色体工程的集成，极大地缩短了优异等位基因的聚合时间。
此外，配套开发的TKO_PegDesigner在线工具和TRL质粒组装策略，为全球植物科学家提供了易于操作的技术支持。尽管目前TRIM系统在双子叶植物中的效率仍受限于PE系统的总体水平，但随着未来引导编辑器的持续优化及新型重组酶的挖掘，该系统有望扩展至更多物种。这一成果不仅加速了植物功能基因组学的基础研究，更为未来全球粮食安全所需的精准、智能育种提供了强有力的技术支撑。
该研究的第一作者为中国科学院遗传与发育生物学研究所的 Hongchao Li和 Zhuangzhuang Chai，通讯作者为该所的 高彩霞。研究得到了国家自然科学基金、科技部“十四五”国家重点研发计划、新基石科学基金会等项目的资助。
DOI 链接：https://doi.org/10.1038/s41587-026-03174-5
小麦族多组学网站：http://wheatomics.sdau.edu.cn
投稿、合作等邮箱：shengweima@icloud.com
（来源：小麦研究联盟）
随着植物功能基因组学的飞速发展，研究人员已经在主要农作物中鉴定出大量与高产、优质及抗逆性相关的优异等位基因。在现代精准育种中，一个核心目标是将这些分布在不同品种中的优异性状快速聚合到精英品种中。然而，这一过程面临巨大的技术挑战。当前的基因组编辑策略通常需要针对不同的突变类型使用不同的工具，例如：使用Cas9进行基因敲除（KO）、使用碱基编辑器进行单核苷酸替换、以及使用引导编辑（Prime Editing, PE）进行小片段的精准修饰。这种“分而治之”的方法迫使育种家不得不进行多轮迭代编辑，或者在不同品系中平行编辑后再通过耗时的杂交进行聚合，效率极其低下。
此外，传统的Cas9介导的基因敲除依赖于双链断裂（DSB）引发的随机修复，这往往会产生约20%的“框内突变”（in-frame mutations），即突变后的蛋白质仅增减了几个氨基酸但仍保留功能。在处理像小麦这样的多倍体作物时，这种不完全敲除会导致目标性状无法完全显现。因此，开发一种能够在一个系统中同时实现多种类型精准编辑，且能高效、彻底敲除目标的“全能型”编辑工具，对于植物生物技术和作物改良具有重要意义。
中国科学院遗传与发育生物学研究所的高彩霞团队在 Nature Biotechnology发表了题为“Multiplexed, precise genome engineering in monocots with twin prime editing systems”的论文，揭示了一种基于双引导编辑（twin PE）的新型基因组工程系统。该研究首先开发了基于终止密码子集群（SCC）安装的敲除系统（TKO），能够在不依赖DSB修复的情况下实现精准的翻译终止。随后，研究团队通过整合TKO、传统引导编辑及重组酶系统，构建了TRIM1和TRIM2多功能编辑平台。这些系统在水稻、玉米和小麦中表现出极高的精准度和多重编辑能力，不仅显著降低了框内突变的比例，还实现了从单碱基到千碱基尺度的多目标同时修饰，为作物育种提供了一套灵活、高效且可扩展的“全能型”工具箱。
高效TKO编辑器的开发
研究团队最初尝试使用单pegRNA引导编辑系统引入敲除突变（如单碱基插入或终止密码子替换），但在水稻原生质体中的效率均低于4.2%。受双引导编辑（twinPE）替换小片段能力的启发，研究者设计了TKO系统，通过在目标位点精准插入一段短的SCC序列来实现敲除。SCC的设计遵循四大原则：优先使用TAA和TAG以减少读通、包含三个不同框架的终止密码子以确保彻底终止、使用胞嘧啶（C）作为DNA末端以及优化RT模板的二级结构。
在对18种SCC变体进行筛选后，发现SCC11（27 bp）在水稻多个内源基因上的平均精准插入效率高达66.8%（图1b-d）。进一步优化发现，当两个切口（nicks）之间的距离在30–50 bp时，TKO系统的活性达到峰值（图1e）。与单pegRNA策略相比，TKO系统的敲除效率提升了8.1–66.9倍。
TKO在单子叶植物中的高效性与精准性
研究团队在水稻和玉米中对比了TKO与传统Cas9系统的性能。结果显示，TKO在水稻原生质体中的敲除效率最高可达70.5%，平均比Cas9系统高出2倍以上（图2b）。更关键的是，Cas9产生的突变中有约16%为框内突变，可能导致蛋白质功能残余；而TKO系统通过预设的SCC序列强制终止翻译，产生的框内突变极少（图2c）。
在水稻稳定转化实验中，TKO介导的OsKRN2或OsPDS敲除频率高达96.8%。值得注意的是，Cas9产生的OsPDS框内突变（如ΔE229）植株表现出野生型表型，而TKO产生的突变体则表现出完全的白化表型，证明了TKO敲除的彻底性（图2f-h）。由于TKO突变是可预测的，研究者还开发了一种名为DVM的简易分型方法，仅通过凝胶电泳即可直观区分纯合、杂合及野生型植株，显著降低了检测成本。在玉米中，TKO的平均敲除效率也达到了47.8%，比Cas9系统高3.0–8.5倍（图2e）。
小麦多同源基因的高效同时敲除
在六倍体小麦中，同时敲除三个同源基因（A、B、D基因组）是一大难题。研究发现，TKO在小麦原生质体中的同源基因敲除效率高达75.1%（图2f）。通过粒子轰击法转化小麦幼胚，TKO在产生三基因同时敲除突变体方面的频率比Cas9高出4.2倍（图2d）。这主要归功于TKO规避了框内突变，确保了每个同源副本都被彻底破坏。这一突破意味着研究者可以在单次转化中直接获得完全敲除的植株，无需多代杂交聚合。
正交TKO系统实现大规模多基因敲除
为了实现多基因同时敲除而不产生异位重组（跨位点串扰），研究团队开发了正交TKO系统。他们筛选并验证了10个具有序列特异性且互不干扰的正交SCC变体（图3a-e）。利用这一系统，研究者在水稻中实现了多达10个基因的同时敲除。通过优化pegRNA的处理方式（如使用不同的tRNA或HDV核酶），多重编辑频率显著提升。在T0代水稻中，四基因同时敲除的频率比Cas9系统提高了0.2–4.6倍（图3h）。
TRIM1和TRIM2：集成式多功能编辑平台
研究团队最终建立了两个集成平台：
TRIM1系统：将TKO与单/双pegRNA引导编辑整合。在水稻中，使用一个包含23个pegRNA的质粒，TRIM1成功实现了对12个基因的编辑。在稳定转化中，TRIM1在水稻中实现了22.8%的四基因共编辑频率，包括敲除OsKRN2并对另外三个位点进行精准纯合修饰，成功聚合了抗草甘膦、株型紧凑及高产等性状（图4c-e）。
TRIM2系统：将Cre重组酶与PE融合。该系统不仅能完成TRIM1的所有功能，还能通过PE引入重组位点（RS），再利用重组酶介导千碱基尺度的大片段操作。研究证明，TRIM2能在敲除基因的同时，在水稻原生质体中实现4.9 kb大片段的精准插入（效率1.2%）和高达79.8%的基因敲除（图4j）。
全文总结与展望
本研究开发的TKO及TRIM系统标志着农作物基因组工程进入了“多功能、高精准、高效率”的新阶段。TKO编辑器通过精准安装SCC序列，解决了传统Cas9敲除中框内突变导致的“敲除不彻底”难题，特别是在多倍体小麦改良中展现出巨大优势。TRIM系列平台则首次在单子叶植物中实现了从单点精准修饰到大规模染色体工程的集成，极大地缩短了优异等位基因的聚合时间。
此外，配套开发的TKO_PegDesigner在线工具和TRL质粒组装策略，为全球植物科学家提供了易于操作的技术支持。尽管目前TRIM系统在双子叶植物中的效率仍受限于PE系统的总体水平，但随着未来引导编辑器的持续优化及新型重组酶的挖掘，该系统有望扩展至更多物种。这一成果不仅加速了植物功能基因组学的基础研究，更为未来全球粮食安全所需的精准、智能育种提供了强有力的技术支撑。
该研究的第一作者为中国科学院遗传与发育生物学研究所的 Hongchao Li和 Zhuangzhuang Chai，通讯作者为该所的 高彩霞。研究得到了国家自然科学基金、科技部“十四五”国家重点研发计划、新基石科学基金会等项目的资助。
DOI 链接：https://doi.org/10.1038/s41587-026-03174-5
小麦族多组学网站：http://wheatomics.sdau.edu.cn
投稿、合作等邮箱：shengweima@icloud.com
