导语：结直肠癌(CRC)发病率与死亡率持续攀升，其发生与肠道菌群紊乱及免疫功能失调密切相关。尽管已有研究证实禁食模拟饮食(FMD)可增强抗肿瘤免疫，但肠道菌群在这一过程中的具体作用路径尚未明晰。当前领域的核心挑战在于：如何解析饮食干预与肠道微生物的动态互作关系，以及这种互作如何调控肿瘤微环境中的免疫细胞功能。例如，肠道菌群代谢产物如氨基酸可影响肿瘤进展，但FMD是否通过富集特定益生菌、重塑代谢微环境从而增强抗肿瘤效应仍需验证。
2025年1月，Gut发表的一项研究指出，FMD通过富集长双歧杆菌伪长亚种(Bifidobacterium pseudolongum)及其代谢产物L-精氨酸，诱导组织驻留记忆CD8+ T细胞(TRM)分化，为CRC免疫治疗提供了新视角。
多维度实验设计解析菌群-免疫调控机制临床与基础研究并行探索
本研究是一项结合动物模型与临床样本的转化医学研究，旨在系统揭示FMD通过肠道菌群抑制CRC的分子机制。研究纳入106例CRC患者，其中94例(队列1)用于分析肿瘤组织中菌群丰度与TRM细胞浸润的相关性，22例(队列2)参与FMD临床干预试验。动物实验构建了MC38原位CRC小鼠模型、AOM/DSS诱导CRC模型及无菌小鼠模型，设置对照组、FMD组、抗生素清除菌群+FMD组、B. pseudolongum或罗伊氏乳杆菌干预组等。干预措施包括周期性低热量饮食(FMD)、益生菌灌胃及抗生素清除肠道菌群。主要评价指标为肿瘤体积与重量、肠道菌群多样性(16S rRNA测序)、TRM细胞比例(流式细胞术及单细胞RNA测序);次要指标涵盖代谢产物检测(如L-精氨酸)、免疫检查点分子表达及临床预后分析(生存曲线、Cox回归)。
长双歧杆菌伪长亚种驱动FMD抗肿瘤效应
L-精氨酸-TRM轴激活免疫监视网络
FMD的抗肿瘤效应依赖于肠道菌群，且显著富集Bifidobacterium pseudolongum
通过MC38原位结直肠癌小鼠模型及AOM/DSS诱导模型验证，FMD干预可使肿瘤重量降低约30%、体积缩小约40%(图1B、在线补充图1B)，且不伴随显著体重下降(体重丢失<20%，在线补充图1D-E)。16S rRNA测序显示，FMD组肠道菌群α多样性(Simpson指数)较对照组升高1%(p=0.026，图1E)，β多样性分析(Bray-Curtis距离)显示菌群结构显著差异(Stress=0.049，图1F)。进一步通过抗生素清除菌群后，FMD的抑癌作用完全消失(肿瘤重量：ABX+FMD组vsFMD组，p=0.0089;图1H-I)，证实肠道菌群是FMD发挥效应的必要条件。
菌群差异分析显示，FMD组显著富集Bifidobacterium(双歧杆菌属)、Lactobacillus(乳杆菌属)等益生菌，其中Bifidobacterium pseudolongum(长双歧杆菌伪长亚种)丰度提升最为显著(p=0.0039，图1L)，其在属水平的丰度差异通过线性判别分析(LDA score>2.5，图1J)及t检验(p=0.0139，图1K)双重验证。
图1 FMD的抗肿瘤效应由肠道微生物群介导
(A)FMD模型时间线示意图(B) MC38诱导的原位CRC小鼠的肿瘤重量和大小(对照组n=19，FMD组n=23)(C) 16S rRNA测序工作流程示意图(D) 不同处理的原位CRC模型小鼠粪便样本中优势门和目的平均相对丰度(E) 基于Simpson指数的16S rRNA测序α多样性分析(p=0.026)(F) 基于OTU水平组成谱的Bray-Curtis相异矩阵的β多样性非度量多维标度分析(NMDS，Stress=0.049)(G) 实验设计时间线示意图(H) 对照组、FMD组及广谱抗生素(ABX)处理后FMD组的MC38诱导原位CRC模型小鼠结肠肿瘤代表性图像(I) MC38诱导原位CRC模型小鼠的肿瘤重量和大小(对照组n=6，FMD组n=6，ABX+FMD组n=6;p值通过单因素方差分析及Tukey事后多重比较检验得出)(J) 对照组与FMD组粪便样本微生物组成的线性判别分析(LDA，LDA评分>2.5表示差异显著)(K) 属水平微生物组成的t检验分析(每组n=6)(L) 罗伊氏乳杆菌和长双歧杆菌伪长亚种的相对丰度(对照组n=6，FMD组n=6;p值通过Student’s t检验得出) B. pseudolongum单菌定植可完全模拟FMD的抗肿瘤效应，且不依赖宿主固有菌群
在抗生素预处理的常规小鼠中，单独灌胃B. pseudolongum(1×10⁹ CFU/天)可使肿瘤体积缩小45%(p=0.0025，图2F)，效果与FMD相当;而罗伊氏乳杆菌(L. reuteri)干预无显著抑癌作用(图2C)。在无菌小鼠模型中，FMD无法抑制肿瘤生长(图2H)，但B. pseudolongum单菌定植可使肿瘤重量降低约50%(p=0.0019，图2I)，且恢复TRM细胞浸润(图3G)，提示其作用独立于宿主原有菌群。粪便定植实验显示，B. pseudolongum在肠道内可稳定增殖(接种后1天粪便菌量>1×10⁸ CFU/g)。
图2 长双歧杆菌伪长亚种模拟FMD的抗肿瘤效应
(A)实验设计时间线示意图：常规小鼠经ABX处理后，接种MC38细胞并给予罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌伪长亚种及其组合灌胃，随后进行FMD处理(B) 代表性肿瘤图片(C) MC38诱导原位CRC模型小鼠的肿瘤重量和大小(ABX+FMD组n=6，ABX+长双歧杆菌伪长亚种+FMD组n=6，ABX+罗伊氏乳杆菌+FMD组n=6，ABX+长双歧杆菌伪长亚种+罗伊氏乳杆菌+FMD组n=6，FMD组n=6;p值通过单因素方差分析及Tukey事后多重比较检验得出)(D) 实验设计时间线示意图：常规小鼠经ABX处理后，接种MC38细胞并给予长双歧杆菌伪长亚种灌胃(E) 代表性肿瘤图片(F) MC38诱导原位CRC模型小鼠的肿瘤重量和大小(对照组n=6，长双歧杆菌伪长亚种+对照组n=6;p值通过Student’s t检验得出)(G) 实验设计时间线示意图：无菌小鼠接种MC38细胞后，给予长双歧杆菌伪长亚种灌胃并进行FMD处理(H) 代表性肿瘤图片(I) MC38诱导无菌原位CRC模型小鼠的肿瘤重量和大小(对照组n=6，FMD组n=6，长双歧杆菌伪长亚种+FMD组n=6，长双歧杆菌伪长亚种+对照组n=6;p值通过单因素方差分析及Tukey事后多重比较检验得出) FMD通过B. pseudolongum诱导CD8+组织驻留记忆T细胞(TRM)富集
单细胞RNA测序(scRNA-seq)显示，FMD组肿瘤浸润CD8+ T细胞中TRM细胞(CD69⁺CD103⁺)比例显著升高，占CD8+ T细胞的15.0%，较对照组(5.16%)增加近2倍(p=0.0130，图3C)。基因本体论(GO)分析显示，TRM细胞高表达核糖体生物合成、蛋白折叠相关基因，低表达适应性免疫应答及细胞增殖基因(图3D-E)。伪时间轨迹分析(Monocle算法)表明，TRM细胞由循环态前体细胞分化而来，与效应记忆T细胞(TEM)分属不同功能分支(图3F)。
图3 FMD通过长双歧杆菌伪长亚种依赖性增加CD8+ TRM细胞
(A)每组四只小鼠混合样本的scRNA-seq工作流程示意图;T细胞总体及CD8+ T细胞重聚类的UMAP图(B) 各CD8+ T细胞簇中特征基因的小提琴图(C) 通过倍数变化(FMD/对照组)鉴定的差异亚群(D) 不同TRM细胞亚型中GO分析(生物过程)的上调基因(E) 不同TRM细胞亚型中GO分析(生物过程)的下调基因(F) 不同CD8+ T细胞亚群的细胞状态转移轨迹(Monocle算法)(G) 无菌小鼠实验中每组一只小鼠的代表性流式细胞术图
在无菌小鼠中，FMD无法诱导TRM细胞富集(TRM比例：9.44%vs对照组8.02%，p>0.05)，而B. pseudolongum补充可使TRM比例提升至29.0%(p<0.0001，图3G)，证实TRM诱导依赖于该菌种。临床样本中，队列1(94例患者)显示B. pseudolongum丰度与CD8+ TRM细胞浸润呈正相关(R=0.6179，p<0.0001，图6D)，且两者均为独立预后因子(HR分别为0.435和0.347，p=0.011和0.002，图6M)。 B. pseudolongum通过代谢产物L–精氨酸激活SLC7A1受体介导TRM分化
非靶向代谢组学检测到FMD组粪便中17种代谢物显著富集，其中L–精氨酸水平提升最为显著(log₂FC=2.1，p=0.0049，图4B-C)，且与B. pseudolongum丰度呈强正相关(R=0.7971，p=0.0058，图4D)。体外实验显示，L–精氨酸(1.5mg/g体重)可使CD8+ T细胞中TRM表型比例从5.59%提升至14.0%(p=0.0009，图4F)，并增强IFN-γ、颗粒酶B等效应分子表达。
机制研究发现，CD8+ TRM细胞高表达SLC7A1(精氨酸转运受体)，其mRNA及蛋白水平较效应T细胞高2-3倍。敲除SLC7A1(shSlc7a1转染)后，L–精氨酸诱导的TRM分化被完全阻断(TRM比例：5.12%vs对照组4.89%，p>0.05，图4H-I)，且过继转移实验显示SLC7A1缺陷型T细胞无法响FMD-B. pseudolongum轴的抑癌效应(肿瘤重量：shSlc7a1组vs对照组，p=0.0128，图4G)。
图4 FMD通过长双歧杆菌伪长亚种产生的L-精氨酸激活CD8+ TRM细胞
(A)两次FMD周期后MC38诱导原位CRC小鼠粪便非靶向代谢组学工作流程示意图(B) MC38诱导原位CRC小鼠粪便中差异微生物代谢物火山图(显著差异定义为log₂FC>1.5，Wilcoxon秩和检验)(C) MC38诱导原位CRC小鼠粪便中的L-精氨酸水平(对照组n=6，FMD组n=6;中线表示中位数，p=0.0049)(D) 长双歧杆菌伪长亚种与L-精氨酸的相关性分析(R=0.7971，p=0.0058)(E) MC38诱导原位CRC模型小鼠的结肠肿瘤代表性图像及肿瘤重量和大小分析(对照组n=6，L-精氨酸组n=6;p值通过Student’s t检验得出)(F) L-精氨酸补充实验中每组一只小鼠的代表性流式细胞术图：分析肿瘤组织中浸润的CD8+ CD103+ CD69+ T细胞百分比(对照组n=6，L-精氨酸组n=6;p值通过Student’s t检验得出)(G) 实验设计时间线示意图(H) 代表性肿瘤图片及肿瘤重量和大小分析(I) 过继转移实验中每组一只小鼠的代表性流式细胞术图：分析肿瘤组织中浸润的CD8+ CD103+ CD69+ T细胞百分比(J) 研究机制示意图 B. pseudolongum增强抗CTLA-4免疫治疗敏感性
在MC38(MSI-H)及CT26(MSI-L)小鼠模型中，FMD联合抗CTLA-4治疗可使肿瘤体积进一步缩小约30%(p=0.0059，图5D)，较单药组显著提升疗效。抗生素清除菌群后，联合治疗效果消失(肿瘤重量：ABX+FMD +抗CTLA-4组vsFMD+抗CTLA-4组，p=0.0415，图5C)，而B. pseudolongum补充可逆转这一现象(肿瘤体积：益生菌联合组vs单纯抗CTLA-4组，p=0.004，图5H)。机制上，该菌种可降低PD1⁺Lag3⁺耗竭性T细胞比例(p=0.0008，图5I-J)，同时提升CD107a⁺IFN-γ⁺效应T细胞比例(p=0.01，图5K)。
图5 FMD和长双歧杆菌伪长亚种增强抗CTLA-4在原位模型小鼠中的疗效
(A)MC38原位小鼠实验设计时间线示意图(B) 结肠肿瘤代表性图像(C-D) 肿瘤重量(C)和大小(D)分析(E) 实验设计时间线示意图(F) 结肠肿瘤代表性图像(G-H) 肿瘤重量(G)和大小(H)分析(I-J) PD1+CD8+ T细胞(I)和 Lag3+CD8+ T 细胞(J)的代表性直方图及平均荧光强度(MFI)分析(K) CD107a+CD8+ T细胞和IFN-γ+CD8+ T细胞的代表性流式细胞术图及百分比分析。 临床队列验证FMD-菌群-TRM轴的相关性
队列2(22例患者)的临床trial显示，FMD干预后肿瘤组织中B. pseudolongum丰度(AOD值：0.435 vs 0.211，p=0.0041，图6G)、L-精氨酸水平(p=0.0046，图6I)及CD8+ TRM细胞比例(43.1%vs21.3%，p=0.004，图6H)均显著升高，且三者呈正相关(R=0.6179，图6J)。粪便代谢物检测显示，FMD后L-精氨酸浓度较干预前提升1.8倍(p=0.0101，图6K)，而血清水平无显著变化(p=0.1462，图6L)，提示其作用具有肠道局部特异性。
图6 FMD富集的长双歧杆菌伪长亚种与CRC患者CD8+ TRM细胞相关
(A)队列1 CRC患者肿瘤组织中长双歧杆菌伪长亚种的荧光原位杂交(FISH)染色(16S rDNA绿色，DAPI蓝色)及HE染色(肿瘤部位及癌旁正常组织)，比例尺100 µm;基于长双歧杆菌伪长亚种丰度的Kaplan-Meier总生存曲线(B) 基于CD8+ TRM细胞浸润水平的Kaplan-Meier总生存曲线(TRM高浸润组n=48，TRM低浸润组n=46，p<0.001)(C) 队列1 CRC组织的多重免疫荧光染色(DAPI、CD8、CD103、CD69)及HE染色，比例尺100µm(D) 队列1中长双歧杆菌伪长亚种平均光密度(AOD)与 CD8+ TRM细胞浸润的相关性分析(R=0.6179，p<0.0001)(E) 队列2临床trial(ChiCTR2200062524)流程时间线示意图(F) 队列2 CRC患者肿瘤组织中长双歧杆菌伪长亚种的FISH染色，比例尺500µm(左)和100µm(右)(G) 队列2患者长双歧杆菌伪长亚种的AOD分析(对照组n=11，FMD组n=11，p=0.0041)(H) 队列2中每组患者的代表性流式细胞术图(I) 队列2患者肿瘤组织中L-精氨酸水平分析(p=0.0046)(J) 队列2中长双歧杆菌伪长亚种AOD、L-精氨酸水平与CD8+ TRM细胞的相关性分析(K-L) 队列2患者粪便上清液(K)和血清(L)中 L-精氨酸水平分析(p值通过单因素方差分析及Tukey事后多重比较检验得出)(M) 队列1中总生存(OS)的多变量Cox分析
总结
本研究首次阐明FMD通过富集B. pseudolongum、提升L-精氨酸水平，经SLC7A1受体诱导CD8+ TRM细胞分化的抗肿瘤机制。关键结论包括：B. pseudolongum是FMD抗肿瘤的核心功能菌，其丰度与患者预后正相关;L-精氨酸作为菌群代谢物，通过调控TRM细胞重塑肿瘤免疫微环境;B. pseudolongum可增强抗CTLA-4治疗效果，为免疫联合治疗提供新思路。 研究创新性地将饮食干预、肠道菌群与记忆性T细胞免疫串联，提出“益生菌-代谢物-免疫细胞”三级调控模型，填补了FMD机制研究的空白，并为CRC治疗提供了可转化的干预靶点(如B. pseudolongum制剂、L-精氨酸补充)。未来需进一步验证该机制在不同CRC亚型中的适用性，并探索益生菌与免疫疗法的联合策略，推动临床转化。
参考文献
Nan K, Zhong Z, Yue Y, et al. Fasting-mimicking diet-enriched Bifidobacterium pseudolongum suppresses colorectal cancer by inducing memory CD8+ T cells[J]. Gut, 2025.
导语：结直肠癌(CRC)发病率与死亡率持续攀升，其发生与肠道菌群紊乱及免疫功能失调密切相关。尽管已有研究证实禁食模拟饮食(FMD)可增强抗肿瘤免疫，但肠道菌群在这一过程中的具体作用路径尚未明晰。当前领域的核心挑战在于：如何解析饮食干预与肠道微生物的动态互作关系，以及这种互作如何调控肿瘤微环境中的免疫细胞功能。例如，肠道菌群代谢产物如氨基酸可影响肿瘤进展，但FMD是否通过富集特定益生菌、重塑代谢微环境从而增强抗肿瘤效应仍需验证。
2025年1月，Gut发表的一项研究指出，FMD通过富集长双歧杆菌伪长亚种(Bifidobacterium pseudolongum)及其代谢产物L-精氨酸，诱导组织驻留记忆CD8+ T细胞(TRM)分化，为CRC免疫治疗提供了新视角。
多维度实验设计解析菌群-免疫调控机制临床与基础研究并行探索
本研究是一项结合动物模型与临床样本的转化医学研究，旨在系统揭示FMD通过肠道菌群抑制CRC的分子机制。研究纳入106例CRC患者，其中94例(队列1)用于分析肿瘤组织中菌群丰度与TRM细胞浸润的相关性，22例(队列2)参与FMD临床干预试验。动物实验构建了MC38原位CRC小鼠模型、AOM/DSS诱导CRC模型及无菌小鼠模型，设置对照组、FMD组、抗生素清除菌群+FMD组、B. pseudolongum或罗伊氏乳杆菌干预组等。干预措施包括周期性低热量饮食(FMD)、益生菌灌胃及抗生素清除肠道菌群。主要评价指标为肿瘤体积与重量、肠道菌群多样性(16S rRNA测序)、TRM细胞比例(流式细胞术及单细胞RNA测序);次要指标涵盖代谢产物检测(如L-精氨酸)、免疫检查点分子表达及临床预后分析(生存曲线、Cox回归)。
长双歧杆菌伪长亚种驱动FMD抗肿瘤效应
L-精氨酸-TRM轴激活免疫监视网络
FMD的抗肿瘤效应依赖于肠道菌群，且显著富集Bifidobacterium pseudolongum
通过MC38原位结直肠癌小鼠模型及AOM/DSS诱导模型验证，FMD干预可使肿瘤重量降低约30%、体积缩小约40%(图1B、在线补充图1B)，且不伴随显著体重下降(体重丢失<20%，在线补充图1D-E)。16S rRNA测序显示，FMD组肠道菌群α多样性(Simpson指数)较对照组升高1%(p=0.026，图1E)，β多样性分析(Bray-Curtis距离)显示菌群结构显著差异(Stress=0.049，图1F)。进一步通过抗生素清除菌群后，FMD的抑癌作用完全消失(肿瘤重量：ABX+FMD组vsFMD组，p=0.0089;图1H-I)，证实肠道菌群是FMD发挥效应的必要条件。
菌群差异分析显示，FMD组显著富集Bifidobacterium(双歧杆菌属)、Lactobacillus(乳杆菌属)等益生菌，其中Bifidobacterium pseudolongum(长双歧杆菌伪长亚种)丰度提升最为显著(p=0.0039，图1L)，其在属水平的丰度差异通过线性判别分析(LDA score>2.5，图1J)及t检验(p=0.0139，图1K)双重验证。
图1 FMD的抗肿瘤效应由肠道微生物群介导
(A)FMD模型时间线示意图(B) MC38诱导的原位CRC小鼠的肿瘤重量和大小(对照组n=19，FMD组n=23)(C) 16S rRNA测序工作流程示意图(D) 不同处理的原位CRC模型小鼠粪便样本中优势门和目的平均相对丰度(E) 基于Simpson指数的16S rRNA测序α多样性分析(p=0.026)(F) 基于OTU水平组成谱的Bray-Curtis相异矩阵的β多样性非度量多维标度分析(NMDS，Stress=0.049)(G) 实验设计时间线示意图(H) 对照组、FMD组及广谱抗生素(ABX)处理后FMD组的MC38诱导原位CRC模型小鼠结肠肿瘤代表性图像(I) MC38诱导原位CRC模型小鼠的肿瘤重量和大小(对照组n=6，FMD组n=6，ABX+FMD组n=6;p值通过单因素方差分析及Tukey事后多重比较检验得出)(J) 对照组与FMD组粪便样本微生物组成的线性判别分析(LDA，LDA评分>2.5表示差异显著)(K) 属水平微生物组成的t检验分析(每组n=6)(L) 罗伊氏乳杆菌和长双歧杆菌伪长亚种的相对丰度(对照组n=6，FMD组n=6;p值通过Student’s t检验得出) B. pseudolongum单菌定植可完全模拟FMD的抗肿瘤效应，且不依赖宿主固有菌群
在抗生素预处理的常规小鼠中，单独灌胃B. pseudolongum(1×10⁹ CFU/天)可使肿瘤体积缩小45%(p=0.0025，图2F)，效果与FMD相当;而罗伊氏乳杆菌(L. reuteri)干预无显著抑癌作用(图2C)。在无菌小鼠模型中，FMD无法抑制肿瘤生长(图2H)，但B. pseudolongum单菌定植可使肿瘤重量降低约50%(p=0.0019，图2I)，且恢复TRM细胞浸润(图3G)，提示其作用独立于宿主原有菌群。粪便定植实验显示，B. pseudolongum在肠道内可稳定增殖(接种后1天粪便菌量>1×10⁸ CFU/g)。
图2 长双歧杆菌伪长亚种模拟FMD的抗肿瘤效应
(A)实验设计时间线示意图：常规小鼠经ABX处理后，接种MC38细胞并给予罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌伪长亚种及其组合灌胃，随后进行FMD处理(B) 代表性肿瘤图片(C) MC38诱导原位CRC模型小鼠的肿瘤重量和大小(ABX+FMD组n=6，ABX+长双歧杆菌伪长亚种+FMD组n=6，ABX+罗伊氏乳杆菌+FMD组n=6，ABX+长双歧杆菌伪长亚种+罗伊氏乳杆菌+FMD组n=6，FMD组n=6;p值通过单因素方差分析及Tukey事后多重比较检验得出)(D) 实验设计时间线示意图：常规小鼠经ABX处理后，接种MC38细胞并给予长双歧杆菌伪长亚种灌胃(E) 代表性肿瘤图片(F) MC38诱导原位CRC模型小鼠的肿瘤重量和大小(对照组n=6，长双歧杆菌伪长亚种+对照组n=6;p值通过Student’s t检验得出)(G) 实验设计时间线示意图：无菌小鼠接种MC38细胞后，给予长双歧杆菌伪长亚种灌胃并进行FMD处理(H) 代表性肿瘤图片(I) MC38诱导无菌原位CRC模型小鼠的肿瘤重量和大小(对照组n=6，FMD组n=6，长双歧杆菌伪长亚种+FMD组n=6，长双歧杆菌伪长亚种+对照组n=6;p值通过单因素方差分析及Tukey事后多重比较检验得出) FMD通过B. pseudolongum诱导CD8+组织驻留记忆T细胞(TRM)富集
单细胞RNA测序(scRNA-seq)显示，FMD组肿瘤浸润CD8+ T细胞中TRM细胞(CD69⁺CD103⁺)比例显著升高，占CD8+ T细胞的15.0%，较对照组(5.16%)增加近2倍(p=0.0130，图3C)。基因本体论(GO)分析显示，TRM细胞高表达核糖体生物合成、蛋白折叠相关基因，低表达适应性免疫应答及细胞增殖基因(图3D-E)。伪时间轨迹分析(Monocle算法)表明，TRM细胞由循环态前体细胞分化而来，与效应记忆T细胞(TEM)分属不同功能分支(图3F)。
图3 FMD通过长双歧杆菌伪长亚种依赖性增加CD8+ TRM细胞
(A)每组四只小鼠混合样本的scRNA-seq工作流程示意图;T细胞总体及CD8+ T细胞重聚类的UMAP图(B) 各CD8+ T细胞簇中特征基因的小提琴图(C) 通过倍数变化(FMD/对照组)鉴定的差异亚群(D) 不同TRM细胞亚型中GO分析(生物过程)的上调基因(E) 不同TRM细胞亚型中GO分析(生物过程)的下调基因(F) 不同CD8+ T细胞亚群的细胞状态转移轨迹(Monocle算法)(G) 无菌小鼠实验中每组一只小鼠的代表性流式细胞术图
在无菌小鼠中，FMD无法诱导TRM细胞富集(TRM比例：9.44%vs对照组8.02%，p>0.05)，而B. pseudolongum补充可使TRM比例提升至29.0%(p<0.0001，图3G)，证实TRM诱导依赖于该菌种。临床样本中，队列1(94例患者)显示B. pseudolongum丰度与CD8+ TRM细胞浸润呈正相关(R=0.6179，p<0.0001，图6D)，且两者均为独立预后因子(HR分别为0.435和0.347，p=0.011和0.002，图6M)。 B. pseudolongum通过代谢产物L–精氨酸激活SLC7A1受体介导TRM分化
非靶向代谢组学检测到FMD组粪便中17种代谢物显著富集，其中L–精氨酸水平提升最为显著(log₂FC=2.1，p=0.0049，图4B-C)，且与B. pseudolongum丰度呈强正相关(R=0.7971，p=0.0058，图4D)。体外实验显示，L–精氨酸(1.5mg/g体重)可使CD8+ T细胞中TRM表型比例从5.59%提升至14.0%(p=0.0009，图4F)，并增强IFN-γ、颗粒酶B等效应分子表达。
机制研究发现，CD8+ TRM细胞高表达SLC7A1(精氨酸转运受体)，其mRNA及蛋白水平较效应T细胞高2-3倍。敲除SLC7A1(shSlc7a1转染)后，L–精氨酸诱导的TRM分化被完全阻断(TRM比例：5.12%vs对照组4.89%，p>0.05，图4H-I)，且过继转移实验显示SLC7A1缺陷型T细胞无法响FMD-B. pseudolongum轴的抑癌效应(肿瘤重量：shSlc7a1组vs对照组，p=0.0128，图4G)。
图4 FMD通过长双歧杆菌伪长亚种产生的L-精氨酸激活CD8+ TRM细胞
(A)两次FMD周期后MC38诱导原位CRC小鼠粪便非靶向代谢组学工作流程示意图(B) MC38诱导原位CRC小鼠粪便中差异微生物代谢物火山图(显著差异定义为log₂FC>1.5，Wilcoxon秩和检验)(C) MC38诱导原位CRC小鼠粪便中的L-精氨酸水平(对照组n=6，FMD组n=6;中线表示中位数，p=0.0049)(D) 长双歧杆菌伪长亚种与L-精氨酸的相关性分析(R=0.7971，p=0.0058)(E) MC38诱导原位CRC模型小鼠的结肠肿瘤代表性图像及肿瘤重量和大小分析(对照组n=6，L-精氨酸组n=6;p值通过Student’s t检验得出)(F) L-精氨酸补充实验中每组一只小鼠的代表性流式细胞术图：分析肿瘤组织中浸润的CD8+ CD103+ CD69+ T细胞百分比(对照组n=6，L-精氨酸组n=6;p值通过Student’s t检验得出)(G) 实验设计时间线示意图(H) 代表性肿瘤图片及肿瘤重量和大小分析(I) 过继转移实验中每组一只小鼠的代表性流式细胞术图：分析肿瘤组织中浸润的CD8+ CD103+ CD69+ T细胞百分比(J) 研究机制示意图 B. pseudolongum增强抗CTLA-4免疫治疗敏感性
在MC38(MSI-H)及CT26(MSI-L)小鼠模型中，FMD联合抗CTLA-4治疗可使肿瘤体积进一步缩小约30%(p=0.0059，图5D)，较单药组显著提升疗效。抗生素清除菌群后，联合治疗效果消失(肿瘤重量：ABX+FMD +抗CTLA-4组vsFMD+抗CTLA-4组，p=0.0415，图5C)，而B. pseudolongum补充可逆转这一现象(肿瘤体积：益生菌联合组vs单纯抗CTLA-4组，p=0.004，图5H)。机制上，该菌种可降低PD1⁺Lag3⁺耗竭性T细胞比例(p=0.0008，图5I-J)，同时提升CD107a⁺IFN-γ⁺效应T细胞比例(p=0.01，图5K)。
图5 FMD和长双歧杆菌伪长亚种增强抗CTLA-4在原位模型小鼠中的疗效
(A)MC38原位小鼠实验设计时间线示意图(B) 结肠肿瘤代表性图像(C-D) 肿瘤重量(C)和大小(D)分析(E) 实验设计时间线示意图(F) 结肠肿瘤代表性图像(G-H) 肿瘤重量(G)和大小(H)分析(I-J) PD1+CD8+ T细胞(I)和 Lag3+CD8+ T 细胞(J)的代表性直方图及平均荧光强度(MFI)分析(K) CD107a+CD8+ T细胞和IFN-γ+CD8+ T细胞的代表性流式细胞术图及百分比分析。 临床队列验证FMD-菌群-TRM轴的相关性
队列2(22例患者)的临床trial显示，FMD干预后肿瘤组织中B. pseudolongum丰度(AOD值：0.435 vs 0.211，p=0.0041，图6G)、L-精氨酸水平(p=0.0046，图6I)及CD8+ TRM细胞比例(43.1%vs21.3%，p=0.004，图6H)均显著升高，且三者呈正相关(R=0.6179，图6J)。粪便代谢物检测显示，FMD后L-精氨酸浓度较干预前提升1.8倍(p=0.0101，图6K)，而血清水平无显著变化(p=0.1462，图6L)，提示其作用具有肠道局部特异性。
图6 FMD富集的长双歧杆菌伪长亚种与CRC患者CD8+ TRM细胞相关
(A)队列1 CRC患者肿瘤组织中长双歧杆菌伪长亚种的荧光原位杂交(FISH)染色(16S rDNA绿色，DAPI蓝色)及HE染色(肿瘤部位及癌旁正常组织)，比例尺100 µm;基于长双歧杆菌伪长亚种丰度的Kaplan-Meier总生存曲线(B) 基于CD8+ TRM细胞浸润水平的Kaplan-Meier总生存曲线(TRM高浸润组n=48，TRM低浸润组n=46，p<0.001)(C) 队列1 CRC组织的多重免疫荧光染色(DAPI、CD8、CD103、CD69)及HE染色，比例尺100µm(D) 队列1中长双歧杆菌伪长亚种平均光密度(AOD)与 CD8+ TRM细胞浸润的相关性分析(R=0.6179，p<0.0001)(E) 队列2临床trial(ChiCTR2200062524)流程时间线示意图(F) 队列2 CRC患者肿瘤组织中长双歧杆菌伪长亚种的FISH染色，比例尺500µm(左)和100µm(右)(G) 队列2患者长双歧杆菌伪长亚种的AOD分析(对照组n=11，FMD组n=11，p=0.0041)(H) 队列2中每组患者的代表性流式细胞术图(I) 队列2患者肿瘤组织中L-精氨酸水平分析(p=0.0046)(J) 队列2中长双歧杆菌伪长亚种AOD、L-精氨酸水平与CD8+ TRM细胞的相关性分析(K-L) 队列2患者粪便上清液(K)和血清(L)中 L-精氨酸水平分析(p值通过单因素方差分析及Tukey事后多重比较检验得出)(M) 队列1中总生存(OS)的多变量Cox分析
总结
本研究首次阐明FMD通过富集B. pseudolongum、提升L-精氨酸水平，经SLC7A1受体诱导CD8+ TRM细胞分化的抗肿瘤机制。关键结论包括：B. pseudolongum是FMD抗肿瘤的核心功能菌，其丰度与患者预后正相关;L-精氨酸作为菌群代谢物，通过调控TRM细胞重塑肿瘤免疫微环境;B. pseudolongum可增强抗CTLA-4治疗效果，为免疫联合治疗提供新思路。 研究创新性地将饮食干预、肠道菌群与记忆性T细胞免疫串联，提出“益生菌-代谢物-免疫细胞”三级调控模型，填补了FMD机制研究的空白，并为CRC治疗提供了可转化的干预靶点(如B. pseudolongum制剂、L-精氨酸补充)。未来需进一步验证该机制在不同CRC亚型中的适用性，并探索益生菌与免疫疗法的联合策略，推动临床转化。
参考文献
Nan K, Zhong Z, Yue Y, et al. Fasting-mimicking diet-enriched Bifidobacterium pseudolongum suppresses colorectal cancer by inducing memory CD8+ T cells[J]. Gut, 2025.
