导语：肝细胞癌(HCC)是全球第三大癌症相关死亡原因，晚期患者预后差，免疫检查点抑制剂(ICB)虽带来希望，但仅不足 20% 患者获益，核心瓶颈在于肿瘤微环境(TME)的免疫抑制。CD8+T 细胞作为抗肿瘤免疫的核心效应细胞，其在 TME 中的功能耗竭是 ICB 耐药的关键因素。目前已知肿瘤代谢产物如乳酸、犬尿氨酸等可抑制 CD8+T 细胞，但具体分子机制仍不明确，尤其是代谢通路与免疫调控的交叉作用亟待突破。
2025 年 1 月，Signal Transduction and Targeted Therapy发表了一篇题为 “VCP downstream metabolite glycerol-3-phosphate (G3P) inhibits CD8+ T cells function in the HCC microenvironment” 的文章，聚焦VCP-G3P 代谢轴，首次揭示了肿瘤细胞通过调控代谢产物抑制 CD8+T 细胞的新机制，为突破肝癌免疫治疗困境提供了潜在上游靶点。
多维度实验解析代谢 - 免疫互作：从分子机制到联合治疗的跨尺度研究设计
本研究是一项基础机制验证结合动物模型的转化医学研究，旨在阐明肝癌微环境中 CD8+T 细胞功能抑制的代谢调控机制，并探索潜在治疗策略。研究首先通过体内外实验(如Transwell 共培养、条件培养基分离)验证 VCP 对CD8+T 细胞浸润、活化及细胞毒性的影响，利用代谢组学筛选关键代谢物 G3P，通过免疫共沉淀、分子对接等技术解析 VCP-GPD1L-G3P-LCK 信号轴的分子互作机制。
实验设计包含：① 细胞水平：Hepa1-6 肝癌细胞与CD8+T 细胞共培养，检测细胞毒性、凋亡及细胞因子分泌;② 动物模型：构建 VCP 过表达 / 敲除的 HCC 小鼠模型，结合免疫缺陷与免疫健全小鼠，评估肿瘤生长与免疫细胞浸润;③ 临床相关性：分析 90 例 HCC 患者组织芯片中 VCP 与 CD8+T 细胞、颗粒酶B 的表达相关性;④ 治疗验证：联用 VCP 抑制剂 CB-5083 与抗 PD-1 抗体，观察肿瘤控制与免疫功能恢复。
VCP-G3P 轴锁定免疫抑制核心，联合治疗重塑微环境显协同效应
VCP 通过抑制CD8+T 细胞功能促进肝癌进展
VCP 表达与CD8+T 细胞浸润及功能呈显著负相关。在免疫健全的 C57BL/6 小鼠肝癌模型中，VCP 过表达组肿瘤体积较对照组显著增大(图 1d-f，Day30 生物发光信号：VCP 组vs 对照组 = 3.2±0.5 vs 1.1±0.3，P<0.001)，生存期缩短(中位生存期：VCP 组 28 天 vs 对照组 42 天，P<0.0001，图 1g)。单细胞 RNA 测序显示，VCP过表达组 CD8+T 细胞比例降低，效应型 CD8+T 细胞(如表达 IFN-γ、颗粒酶 B)亚群显著减少(图 1h-i，t-SNE 分析显示效应CD8+T 细胞占比：VCP 组 12.3% vs 对照组 28.7%，P<0.01)。临床样本验证显示，90 例 HCC 患者中，VCP 表达与 CD8+T 细胞密度(r=-0.6867，P<0.0001，图 1p)、颗粒酶 B 表达(r=-0.7683，P<0.0001，图 1o)呈负相关，且 VCP 高表达患者总生存期(OS)及无病生存期(DFS)更短(TCGA队列，P<0.01)。
图 1 VCP 损害 CD8⁺T 细胞浸润、激活和效应功能以促进 HCC 进展
a, b. 荷 Hepa1-6 裸鼠和 C57BL/6 小鼠在第 31 天处死时的肿瘤体积代表性图像。c. 通过尾静脉将基于转座子和 CRISPR-Cas9 的载体注入小鼠以生成类似人类 HCC 的肝肿瘤的示意图。d, e. C57BL/6 小鼠在质粒注射后指定时间点的生物发光图像。质粒注射后指定时间点 C57BL/6 小鼠的生物发光信号。f. (d) 中肝脏的代表性图像。g. 如 (d) 中处理的C57BL/6 小鼠的 Kaplan-Meier 生存曲线。h, i. CD8⁺T 细胞单细胞 RNA 测序数据的 4 个子簇的 t-SNE 分析。j, k. 用抗CD8 治疗并在第 25 天处死的荷 Hepa1-6 的 C57BL/6 小鼠的肿瘤体积代表性图像(每组 n=5)。l-n. 通过流式细胞术测量自发性肿瘤中 CD8⁺T 细胞百分比(l)、细胞因子产生(颗粒酶 B、IFN-γ)(m)和激活标志物(CD69、CD25、CD44)(n)(每组 n=5)。o. 90 例 HCC 患者的 VCP、CD8α 和 GzmB 免疫组织化学组织微阵列(TMA)代表性图像。p. 对免疫组化染色进行评分，并进行相关性分析(n=90 例患者)。q. 患者 #3 和 #4 中 VCP 和 CD8A 表达的特征评分。r. 对患者临床样本进行 DAPI、CD8α、GzmB 和 VCP 的多重免疫荧光染色。
VCP 通过代谢物G3P 非接触抑制 CD8+T 细胞功能
VCP 缺失通过分泌小分子代谢物恢复 CD8+T 细胞活性。Transwell 共培养实验显示，VCP 敲除的 Hepa1-6 细胞与CD8+T 细胞非接触培养时，肿瘤细胞凋亡率显著升高(Annexin V + 比例：shVCP 组 38.5% vs shCtrl 组 15.2%，P<0.001，图 2f)，CD8+T 细胞增殖(CFSE稀释法，图 2g)及细胞因子分泌(IFN-γ+ 细胞：shVCP 组 27.8% vs shCtrl 组 9.1%，P<0.001，图 2h)显著增强。
图 2 VCP 通过代谢物介导的机制抑制 CD8⁺T 细胞功能
a. CD8⁺T 细胞与 shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞共培养。b. 通过测量 Hepa1-6-OVA 细胞的乳酸脱氢酶(LDHA)释放来评估细胞毒性(n=3)。c. 通过流式细胞术测定与shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞共培养的 Annexin V⁺CD8⁺T 细胞的百分比(n=3)。d. 通过流式细胞术测量与肿瘤细胞共培养的 CD8⁺T 细胞产生的细胞因子百分比(n=3)。e. 使用 Transwell 系统将OT-1 CD8⁺T 细胞与 shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞共培养的示意图。f. 在Transwell 系统中通过流式细胞术测定 Annexin V⁺CD8⁺T 细胞的百分比(n=3)。g. 通过 CFSE 法测量 Transwell 系统中 CD8⁺T 细胞的增殖。h. 通过流式细胞术测量 Transwell 系统中 CD8⁺T 细胞产生的细胞因子百分比(n=3)。i. 用 shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞产生的条件培养基(CM)培养CD8⁺T 细胞的示意图。j. 通过 CFSE 法测量用 shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞产生的 CM 培养的 CD8⁺T 细胞的增殖。k. 通过流式细胞术测量用 shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞产生的 CM 培养的 CD8⁺T 细胞产生的细胞因子百分比(n=3)。l. 用 shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞产生的 CM 培养的 CD8⁺T 细胞分泌的IFN-γ 水平(n=3)。m. 用 shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞产生的 > 3 kDa 或 < 3 kDa CM 培养 CD8⁺T 细胞的示意图。n. 通过流式细胞术测量用 shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞产生的 > 3 kDa 或 < 3 kDa CM 培养的 CD8⁺T 细胞产生的细胞因子百分比(n=3)。o. 通过 CCK8 法测量用shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞产生的 > 3 kDa 或 < 3 kDa CM 培养的 CD8⁺T 细胞的增殖(n=3)。p. 通过 CFSE 法测量用shCtrl 或 shVCP HCCLM3 细胞产生的> 3 kDa 或 < 3 kDa CM 培养的人CD8⁺T 细胞的增殖。q. 通过流式细胞术测量用shCtrl 或 shVCP HCCLM3 细胞产生的> 3 kDa 或 < 3 kDa CM 培养的人CD8⁺T 细胞产生的细胞因子百分比(n=3)。r. 通过流式细胞术测定用 shCtrl 或 shVCP HCCLM3 细胞产生的 > 3 kDa 或 < 3 kDa CM 培养的人 CD8⁺T 细胞中激活标志物的表达(n=3)。
条件培养基(CM)实验表明，VCP 敲除细胞的 CM(<3kDa 代谢物组分)可逆转 CD8+T 细胞抑制，而补充 G3P(≥200μM)则抵消该效应(图3g-i)。人源 CD8+T 细胞实验显示，G3P 处理后增殖抑制率达 45.6%(P<0.001，图 3j-k)，凋亡率升高 2.3 倍(P<0.01，图 3l)，激活标志物 CD69/CD25 表达降低(图 3o)。
图 3 VCP 通过下游代谢物 G3P 发挥作用
a. shVCP HCCLM3 细胞与对照组的条件培养基中代谢物变化的火山图。b. G3P代谢示意图。c. shCtrl 或 shVCP HCCLM3 细胞的细胞外 G3P 水平(n=3)。d. HCCLM3 细胞的新鲜培养基(FM)和条件培养基(CM)中的 G3P 水平(n=3)。e. 自发性肿瘤间质液中的 G3P 水平(n=3)。f. HCC 患者肿瘤间质液(TIF)和血浆中的 G3P 水平(n=31)。g. 使用 Transwell 系统，通过 CCK8 法测量与 shCtrl 或shVcp Hepa1-6-OVA 细胞共培养或用 G3P 处理的 CD8⁺T 细胞的增殖(n=3)。h, i. 如 (g) 中处理的 CD8⁺T 细胞产生的细胞因子百分比(h)和激活标志物(i)通过流式细胞术测量(n=3)。j. 通过 CFSE 法测量用 G3P 处理的人 CD8⁺T 细胞的增殖。k. 通过 CCK8 法测量用 G3P 处理的人 CD8⁺T 细胞的增殖(n=3)。l. 通过流式细胞术测定用 G3P 处理的人 CD8⁺T 细胞的 Annexin V⁺百分比(n=3)。m. 通过流式细胞术测量用 G3P 处理的人 CD8⁺T 细胞产生的细胞因子百分比。n. 用 G3P 处理 24 小时后，人 CD8⁺T 细胞分泌的IFN-γ 水平(n=3)。o. 通过流式细胞术测定用 G3P 处理的人 CD8⁺T 细胞中激活标志物的表达。p, q. 荷 Hepa1-6 的C57BL/6 小鼠瘤内注射 PBS/G3P 后在第 25 天处死时的肿瘤体积代表性图像(每组 n=5)。
VCP 通过稳定GPD1L 促进 G3P 积累
VCP 通过泛素- 蛋白酶体途径维持 GPD1L 蛋白稳定性。RT-qPCR 显示，VCP 敲除不影响 GPD1L mRNA 水平，但显著降低其蛋白表达(图 4b)，而 VCP 过表达则呈剂量依赖性升高 GPD1L(图 4c)。蛋白酶体抑制剂MG132 可恢复 VCP 缺失细胞的 GPD1L 水平，且 VCP 与 GPD1L 直接结合(免疫共沉淀及 GST pull-down，图 4i-k)，其 D1 结构域(Δ208-470aa)与GPD1L 的 Δ192-351aa 片段互作(图 4n-p)。代谢组学显示，VCP 敲除细胞内外 G3P 水平显著降低(细胞外 G3P：shVCP 组58.2±12.3μM vs shCtrl 组 189.5±25.6μM，P<0.001，图 3c)，而 GPD1L 过表达可逆转这一趋势(图 4q-r)。
图 4 VCP 维持 GPD1L 稳定性以在 HCC 中积累 G3P
a. qPCR 分析稳定表达 shCtrl 或 shVcp 的 Hepa1-6 细胞中 Vcp、Gpd1和 Gpd1l 的表达(n=3)。b. 稳定表达 shCtrl 或shVcp 的 Hepa1-6 细胞中所示蛋白质的免疫印迹分析。c. 转染不同量 FLAG-VCP 的HCCLM3 细胞中所示蛋白质的免疫印迹分析。d. 用梯度浓度的 CB-5083 或溶媒处理 24 小时的 HCCLM3 细胞中所示蛋白质的免疫印迹分析。e, f. 用或不用 100 μg/mL 环己酰亚胺(CHX)处理指定时间的 shCtrl 或 shVCP HCCLM3 细胞中所示蛋白质的免疫印迹分析。(f) 中显示相对 GPD1L 蛋白水平(GPD1L:β- 肌动蛋白)。g, h. 用 10 μM MG132 处理 8 小时并共转染指定质粒 48 小时的 HCCLM3 细胞中，HA磁珠下拉产物和输入的免疫印迹分析。i. 共转染指定质粒 48 小时的 HCCLM3 细胞中，FLAG 磁珠下拉产物和输入的免疫印迹分析。j. HCCLM3 细胞裂解物用对照 IgG、抗 VCP 抗体进行免疫沉淀。k. 通过将重组 GST-VCP 与预免疫沉淀的 His-GPD1L 蛋白混合进行 GST 下拉实验。l. 使用三维结构推测 VCP 与 GPD1L 的相互作用。m.免疫荧光分析检测 HCCLM3 细胞中 VCP 和 GPD1L 的共定位。n. VCP 和GPD1L 结构示意图。o. 转染 HA-GPD1L 和 FLAG 标记的指定构建体的 293T 细胞中，FLAG 磁珠下拉产物和输入的免疫印迹分析。p. 转染 FLAG-VCP 和 HA 标记的指定构建体的 293T 细胞中，HA 磁珠下拉产物和输入的免疫印迹分析。q. 转染或不转染 HA-GPD1L 48 小时的 shCtrl 和 shVCP HCCLM3 细胞的细胞外 G3P 水平(n=3)。r. 转染或不转染 HA-GPD1L 48 小时的 shCtrl 或 shGPD1L HCCLM3 细胞的细胞内 G3P 水平(n=3)。
G3P 通过结合LCK 抑制 TCR 信号通路
G3P 直接靶向LCK 激酶结构域抑制其活性。Western blot 显示，G3P处理导致 LCK 磷酸化位点 Tyr394(激活型)减少、Tyr505(抑制型)增加(图 6a-b)，且呈剂量依赖性(200μM G3P 时 Tyr394 磷酸化水平下降 62%，P<0.001)。表面等离子共振(BIAcore)证实 G3P 与 LCK直接结合(KD=9.8×10⁻⁶M，图6d-e)，结合区域为 LCK 激酶域 AA330-509(图 6h-o)。
图 5 G3P 通过 LCK 信号抑制 CD8⁺T 细胞
a. TCR 信号通路。b. 与 shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞共培养的 CD8⁺T 细胞在激活5 或 10 分钟或未刺激(0)时的细胞裂解物通过蛋白质免疫印迹(WB)分析。c. 用 G3P 处理或未处理(对照)的小鼠 naive CD8⁺细胞在指定时间激活后的细胞裂解物通过蛋白质免疫印迹(WB)分析。d–g. 左图，用 G3P 处理或未处理(对照)的小鼠 naive CD8⁺T 细胞在刺激后进行免疫染色和共聚焦显微镜成像。右图，平均荧光强度定量。h. 在刺激期间用 G3P 和 / 或 PP2 处理的小鼠 CD8⁺T 细胞中所示蛋白质的免疫印迹分析。i. 通过流式细胞术测定用 G3P 和/ 或 PP2 处理的小鼠 CD8⁺T 细胞中激活标志物的表达(n=3)。j. 通过流式细胞术测量用G3P 和 / 或 PP2 处理的小鼠 CD8⁺T 细胞产生的细胞因子百分比(n=3)。k. 表达野生型 LCK 或 LCK (Y394F) 突变体的 Jurkat T 细胞用 G3P 处理或未处理。
分子对接显示 G3P 与 LCK 的 ATP 结合口袋附近氨基酸(如 R338、K336)形成氢键。LCK 抑制剂 PP2 可完全阻断 G3P 诱导的TCR 信号抑制(图 5h)，而 LCK (Y505F) 突变体对 G3P 不敏感(图 6c)。
图 6 G3P 直接与 LCK 相互作用并抑制其活性
a. 用梯度浓度的 G3P 处理的人 CD8⁺T 细胞的p-LCK (Y394) 水平。b. 用梯度浓度的 G3P 处理的人 CD8⁺T 细胞中所示蛋白质的免疫印迹分析。c. 使用纯化的 LCK 及其突变体与 ATP 和递增剂量的 G3P 孵育的体外激酶测定。d. 纯化的 LCK 蛋白通过 SDS-PAGE 分析，然后进行考马斯蓝染色。e. BIAcore 测量 G3P 与纯化的 LCK 之间的相互作用。f. 使用三维结构推测 LCK 与 G3P 的相互作用。g. LCK 结构示意图。h. 纯化的 LCK (60-240AAs) 区域通过 SDS-PAGE 分析，然后进行考马斯蓝染色。i. BIAcore 测量 G3P 与纯化的该区域的相互作用。j. 纯化的 LCK (240-509AAs) 区域通过 SDS-PAGE 分析，然后进行考马斯蓝染色。k. BIAcore 测量 G3P 与纯化的该区域的相互作用。l. 纯化的 LCK (230-390AAs) 区域通过 SDS-PAGE 分析，然后进行考马斯蓝染色。m. BIAcore 测量 G3P 与纯化的该区域的相互作用。n. 纯化的 LCK (330-509AAs) 区域通过 SDS-PAGE 分析，然后进行考马斯蓝染色。o. BIAcore 测量 G3P 与纯化的该区域的相互作用。
靶向VCP 联合抗 PD-1 显著增强抗肿瘤免疫
VCP 抑制剂与抗PD-1 联用可协同抑制肿瘤生长。C57BL/6 小鼠模型中，CB-5083(50mg/kg)+ 抗 PD-1 组肿瘤体积较单药组减少 68%(P<0.001，图 7b-c)，CD8+T 细胞浸润增加2.1 倍(P<0.01，图 7d)，效应分子 IFN-γ+ 细胞比例提升至 35.2%(P<0.001，图 7e)。肝特异性 VCP 敲除(Vcp²/²;Alb-Cre)小鼠联合治疗组生存期延长至 56 天(对照组 28 天，P<0.0001，图 7g-i)，肿瘤间质液 G3P 水平降低 51%(P<0.01)。多重免疫荧光显示，联合治疗组 CD8+T 细胞密度及颗粒酶 B 表达显著升高(图 7m)。
图 7 靶向 VCP 联合抗 PD-1 调节 HCC 的肿瘤微环境
a. 荷 Hepa1-6 肿瘤的 C57BL/6 小鼠的治疗方案示意图。b, c. 用载体、抗 PD-1、CB-5083或 CB-5083 + 抗 PD-1 治疗的荷 Hepa1-6 肿瘤的 C57BL/6 小鼠的肿瘤体积代表性图像和定量分析(每组 n=5)。d–f. 通过流式细胞术分析肿瘤中 CD8⁺T 细胞百分比(d)、细胞因子产生(e)和激活标志物(f)(每组 n=5)。g–i. Vcp²/²;Alb-Cre 和对照小鼠的自发 HCC 肿瘤体积(g)、生物发光信号(h)和生存曲线(i)(每组 n=10)。j–l. 通过流式细胞术分析 Vcp²/²;Alb-Cre 和对照小鼠肿瘤中 CD8⁺T 细胞百分比(j)、细胞因子产生(k)和激活标志物(l)(每组 n=5)。m. Vcp²/²;Alb-Cre 和对照小鼠肿瘤的多重免疫荧光染色代表性图像，显示 CD8α 和 GzmB(比例尺：40 μm)。n. 机制示意图：VCP 通过稳定 GPD1L 促进 G3P 积累，G3P结合 LCK 抑制 TCR 信号，联合治疗逆转该过程。
总结
本研究首次揭示 VCP-G3P-LCK 信号轴在肝癌免疫逃逸中的核心作用，将肿瘤代谢异常与 CD8+T细胞功能耗竭直接关联，为理解 TME 免疫抑制提供了新视角。研究不仅鉴定了 VCP 作为上游调控靶点的潜力，还通过联合抗 PD-1 治疗验证了代谢干预与免疫治疗的协同效应，为克服肝癌 ICB 耐药提供了 “代谢重编程 + 免疫激活” 的双重策略。
独特价值在于：① 突破传统代谢物(如乳酸)的研究框架，首次聚焦 G3P 的免疫调控功能;② 发现 VCP 通过稳定代谢酶而非直接参与信号通路发挥作用，拓展了肿瘤代谢 - 免疫互作的机制维度;③ 提出 “靶向 VCP + 抗 PD-1” 的联合疗法，为临床转化提供了可验证的组合策略。未来需进一步在更大临床队列及其他癌种中验证该机制，并开发高效低毒的 VCP 抑制剂，推动代谢免疫联合治疗的临床应用。
参考文献
Cheng C, Zha Q, Sun L, et al. VCP downstream metabolite glycerol-3-phosphate (G3P) inhibits CD8+ T cells function in the HCC microenvironment[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2025, 10(1): 26.
导语：肝细胞癌(HCC)是全球第三大癌症相关死亡原因，晚期患者预后差，免疫检查点抑制剂(ICB)虽带来希望，但仅不足 20% 患者获益，核心瓶颈在于肿瘤微环境(TME)的免疫抑制。CD8+T 细胞作为抗肿瘤免疫的核心效应细胞，其在 TME 中的功能耗竭是 ICB 耐药的关键因素。目前已知肿瘤代谢产物如乳酸、犬尿氨酸等可抑制 CD8+T 细胞，但具体分子机制仍不明确，尤其是代谢通路与免疫调控的交叉作用亟待突破。
2025 年 1 月，Signal Transduction and Targeted Therapy发表了一篇题为 “VCP downstream metabolite glycerol-3-phosphate (G3P) inhibits CD8+ T cells function in the HCC microenvironment” 的文章，聚焦VCP-G3P 代谢轴，首次揭示了肿瘤细胞通过调控代谢产物抑制 CD8+T 细胞的新机制，为突破肝癌免疫治疗困境提供了潜在上游靶点。
多维度实验解析代谢 - 免疫互作：从分子机制到联合治疗的跨尺度研究设计
本研究是一项基础机制验证结合动物模型的转化医学研究，旨在阐明肝癌微环境中 CD8+T 细胞功能抑制的代谢调控机制，并探索潜在治疗策略。研究首先通过体内外实验(如Transwell 共培养、条件培养基分离)验证 VCP 对CD8+T 细胞浸润、活化及细胞毒性的影响，利用代谢组学筛选关键代谢物 G3P，通过免疫共沉淀、分子对接等技术解析 VCP-GPD1L-G3P-LCK 信号轴的分子互作机制。
实验设计包含：① 细胞水平：Hepa1-6 肝癌细胞与CD8+T 细胞共培养，检测细胞毒性、凋亡及细胞因子分泌;② 动物模型：构建 VCP 过表达 / 敲除的 HCC 小鼠模型，结合免疫缺陷与免疫健全小鼠，评估肿瘤生长与免疫细胞浸润;③ 临床相关性：分析 90 例 HCC 患者组织芯片中 VCP 与 CD8+T 细胞、颗粒酶B 的表达相关性;④ 治疗验证：联用 VCP 抑制剂 CB-5083 与抗 PD-1 抗体，观察肿瘤控制与免疫功能恢复。
VCP-G3P 轴锁定免疫抑制核心，联合治疗重塑微环境显协同效应
VCP 通过抑制CD8+T 细胞功能促进肝癌进展
VCP 表达与CD8+T 细胞浸润及功能呈显著负相关。在免疫健全的 C57BL/6 小鼠肝癌模型中，VCP 过表达组肿瘤体积较对照组显著增大(图 1d-f，Day30 生物发光信号：VCP 组vs 对照组 = 3.2±0.5 vs 1.1±0.3，P<0.001)，生存期缩短(中位生存期：VCP 组 28 天 vs 对照组 42 天，P<0.0001，图 1g)。单细胞 RNA 测序显示，VCP过表达组 CD8+T 细胞比例降低，效应型 CD8+T 细胞(如表达 IFN-γ、颗粒酶 B)亚群显著减少(图 1h-i，t-SNE 分析显示效应CD8+T 细胞占比：VCP 组 12.3% vs 对照组 28.7%，P<0.01)。临床样本验证显示，90 例 HCC 患者中，VCP 表达与 CD8+T 细胞密度(r=-0.6867，P<0.0001，图 1p)、颗粒酶 B 表达(r=-0.7683，P<0.0001，图 1o)呈负相关，且 VCP 高表达患者总生存期(OS)及无病生存期(DFS)更短(TCGA队列，P<0.01)。
图 1 VCP 损害 CD8⁺T 细胞浸润、激活和效应功能以促进 HCC 进展
a, b. 荷 Hepa1-6 裸鼠和 C57BL/6 小鼠在第 31 天处死时的肿瘤体积代表性图像。c. 通过尾静脉将基于转座子和 CRISPR-Cas9 的载体注入小鼠以生成类似人类 HCC 的肝肿瘤的示意图。d, e. C57BL/6 小鼠在质粒注射后指定时间点的生物发光图像。质粒注射后指定时间点 C57BL/6 小鼠的生物发光信号。f. (d) 中肝脏的代表性图像。g. 如 (d) 中处理的C57BL/6 小鼠的 Kaplan-Meier 生存曲线。h, i. CD8⁺T 细胞单细胞 RNA 测序数据的 4 个子簇的 t-SNE 分析。j, k. 用抗CD8 治疗并在第 25 天处死的荷 Hepa1-6 的 C57BL/6 小鼠的肿瘤体积代表性图像(每组 n=5)。l-n. 通过流式细胞术测量自发性肿瘤中 CD8⁺T 细胞百分比(l)、细胞因子产生(颗粒酶 B、IFN-γ)(m)和激活标志物(CD69、CD25、CD44)(n)(每组 n=5)。o. 90 例 HCC 患者的 VCP、CD8α 和 GzmB 免疫组织化学组织微阵列(TMA)代表性图像。p. 对免疫组化染色进行评分，并进行相关性分析(n=90 例患者)。q. 患者 #3 和 #4 中 VCP 和 CD8A 表达的特征评分。r. 对患者临床样本进行 DAPI、CD8α、GzmB 和 VCP 的多重免疫荧光染色。
VCP 通过代谢物G3P 非接触抑制 CD8+T 细胞功能
VCP 缺失通过分泌小分子代谢物恢复 CD8+T 细胞活性。Transwell 共培养实验显示，VCP 敲除的 Hepa1-6 细胞与CD8+T 细胞非接触培养时，肿瘤细胞凋亡率显著升高(Annexin V + 比例：shVCP 组 38.5% vs shCtrl 组 15.2%，P<0.001，图 2f)，CD8+T 细胞增殖(CFSE稀释法，图 2g)及细胞因子分泌(IFN-γ+ 细胞：shVCP 组 27.8% vs shCtrl 组 9.1%，P<0.001，图 2h)显著增强。
图 2 VCP 通过代谢物介导的机制抑制 CD8⁺T 细胞功能
a. CD8⁺T 细胞与 shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞共培养。b. 通过测量 Hepa1-6-OVA 细胞的乳酸脱氢酶(LDHA)释放来评估细胞毒性(n=3)。c. 通过流式细胞术测定与shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞共培养的 Annexin V⁺CD8⁺T 细胞的百分比(n=3)。d. 通过流式细胞术测量与肿瘤细胞共培养的 CD8⁺T 细胞产生的细胞因子百分比(n=3)。e. 使用 Transwell 系统将OT-1 CD8⁺T 细胞与 shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞共培养的示意图。f. 在Transwell 系统中通过流式细胞术测定 Annexin V⁺CD8⁺T 细胞的百分比(n=3)。g. 通过 CFSE 法测量 Transwell 系统中 CD8⁺T 细胞的增殖。h. 通过流式细胞术测量 Transwell 系统中 CD8⁺T 细胞产生的细胞因子百分比(n=3)。i. 用 shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞产生的条件培养基(CM)培养CD8⁺T 细胞的示意图。j. 通过 CFSE 法测量用 shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞产生的 CM 培养的 CD8⁺T 细胞的增殖。k. 通过流式细胞术测量用 shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞产生的 CM 培养的 CD8⁺T 细胞产生的细胞因子百分比(n=3)。l. 用 shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞产生的 CM 培养的 CD8⁺T 细胞分泌的IFN-γ 水平(n=3)。m. 用 shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞产生的 > 3 kDa 或 < 3 kDa CM 培养 CD8⁺T 细胞的示意图。n. 通过流式细胞术测量用 shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞产生的 > 3 kDa 或 < 3 kDa CM 培养的 CD8⁺T 细胞产生的细胞因子百分比(n=3)。o. 通过 CCK8 法测量用shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞产生的 > 3 kDa 或 < 3 kDa CM 培养的 CD8⁺T 细胞的增殖(n=3)。p. 通过 CFSE 法测量用shCtrl 或 shVCP HCCLM3 细胞产生的> 3 kDa 或 < 3 kDa CM 培养的人CD8⁺T 细胞的增殖。q. 通过流式细胞术测量用shCtrl 或 shVCP HCCLM3 细胞产生的> 3 kDa 或 < 3 kDa CM 培养的人CD8⁺T 细胞产生的细胞因子百分比(n=3)。r. 通过流式细胞术测定用 shCtrl 或 shVCP HCCLM3 细胞产生的 > 3 kDa 或 < 3 kDa CM 培养的人 CD8⁺T 细胞中激活标志物的表达(n=3)。
条件培养基(CM)实验表明，VCP 敲除细胞的 CM(<3kDa 代谢物组分)可逆转 CD8+T 细胞抑制，而补充 G3P(≥200μM)则抵消该效应(图3g-i)。人源 CD8+T 细胞实验显示，G3P 处理后增殖抑制率达 45.6%(P<0.001，图 3j-k)，凋亡率升高 2.3 倍(P<0.01，图 3l)，激活标志物 CD69/CD25 表达降低(图 3o)。
图 3 VCP 通过下游代谢物 G3P 发挥作用
a. shVCP HCCLM3 细胞与对照组的条件培养基中代谢物变化的火山图。b. G3P代谢示意图。c. shCtrl 或 shVCP HCCLM3 细胞的细胞外 G3P 水平(n=3)。d. HCCLM3 细胞的新鲜培养基(FM)和条件培养基(CM)中的 G3P 水平(n=3)。e. 自发性肿瘤间质液中的 G3P 水平(n=3)。f. HCC 患者肿瘤间质液(TIF)和血浆中的 G3P 水平(n=31)。g. 使用 Transwell 系统，通过 CCK8 法测量与 shCtrl 或shVcp Hepa1-6-OVA 细胞共培养或用 G3P 处理的 CD8⁺T 细胞的增殖(n=3)。h, i. 如 (g) 中处理的 CD8⁺T 细胞产生的细胞因子百分比(h)和激活标志物(i)通过流式细胞术测量(n=3)。j. 通过 CFSE 法测量用 G3P 处理的人 CD8⁺T 细胞的增殖。k. 通过 CCK8 法测量用 G3P 处理的人 CD8⁺T 细胞的增殖(n=3)。l. 通过流式细胞术测定用 G3P 处理的人 CD8⁺T 细胞的 Annexin V⁺百分比(n=3)。m. 通过流式细胞术测量用 G3P 处理的人 CD8⁺T 细胞产生的细胞因子百分比。n. 用 G3P 处理 24 小时后，人 CD8⁺T 细胞分泌的IFN-γ 水平(n=3)。o. 通过流式细胞术测定用 G3P 处理的人 CD8⁺T 细胞中激活标志物的表达。p, q. 荷 Hepa1-6 的C57BL/6 小鼠瘤内注射 PBS/G3P 后在第 25 天处死时的肿瘤体积代表性图像(每组 n=5)。
VCP 通过稳定GPD1L 促进 G3P 积累
VCP 通过泛素- 蛋白酶体途径维持 GPD1L 蛋白稳定性。RT-qPCR 显示，VCP 敲除不影响 GPD1L mRNA 水平，但显著降低其蛋白表达(图 4b)，而 VCP 过表达则呈剂量依赖性升高 GPD1L(图 4c)。蛋白酶体抑制剂MG132 可恢复 VCP 缺失细胞的 GPD1L 水平，且 VCP 与 GPD1L 直接结合(免疫共沉淀及 GST pull-down，图 4i-k)，其 D1 结构域(Δ208-470aa)与GPD1L 的 Δ192-351aa 片段互作(图 4n-p)。代谢组学显示，VCP 敲除细胞内外 G3P 水平显著降低(细胞外 G3P：shVCP 组58.2±12.3μM vs shCtrl 组 189.5±25.6μM，P<0.001，图 3c)，而 GPD1L 过表达可逆转这一趋势(图 4q-r)。
图 4 VCP 维持 GPD1L 稳定性以在 HCC 中积累 G3P
a. qPCR 分析稳定表达 shCtrl 或 shVcp 的 Hepa1-6 细胞中 Vcp、Gpd1和 Gpd1l 的表达(n=3)。b. 稳定表达 shCtrl 或shVcp 的 Hepa1-6 细胞中所示蛋白质的免疫印迹分析。c. 转染不同量 FLAG-VCP 的HCCLM3 细胞中所示蛋白质的免疫印迹分析。d. 用梯度浓度的 CB-5083 或溶媒处理 24 小时的 HCCLM3 细胞中所示蛋白质的免疫印迹分析。e, f. 用或不用 100 μg/mL 环己酰亚胺(CHX)处理指定时间的 shCtrl 或 shVCP HCCLM3 细胞中所示蛋白质的免疫印迹分析。(f) 中显示相对 GPD1L 蛋白水平(GPD1L:β- 肌动蛋白)。g, h. 用 10 μM MG132 处理 8 小时并共转染指定质粒 48 小时的 HCCLM3 细胞中，HA磁珠下拉产物和输入的免疫印迹分析。i. 共转染指定质粒 48 小时的 HCCLM3 细胞中，FLAG 磁珠下拉产物和输入的免疫印迹分析。j. HCCLM3 细胞裂解物用对照 IgG、抗 VCP 抗体进行免疫沉淀。k. 通过将重组 GST-VCP 与预免疫沉淀的 His-GPD1L 蛋白混合进行 GST 下拉实验。l. 使用三维结构推测 VCP 与 GPD1L 的相互作用。m.免疫荧光分析检测 HCCLM3 细胞中 VCP 和 GPD1L 的共定位。n. VCP 和GPD1L 结构示意图。o. 转染 HA-GPD1L 和 FLAG 标记的指定构建体的 293T 细胞中，FLAG 磁珠下拉产物和输入的免疫印迹分析。p. 转染 FLAG-VCP 和 HA 标记的指定构建体的 293T 细胞中，HA 磁珠下拉产物和输入的免疫印迹分析。q. 转染或不转染 HA-GPD1L 48 小时的 shCtrl 和 shVCP HCCLM3 细胞的细胞外 G3P 水平(n=3)。r. 转染或不转染 HA-GPD1L 48 小时的 shCtrl 或 shGPD1L HCCLM3 细胞的细胞内 G3P 水平(n=3)。
G3P 通过结合LCK 抑制 TCR 信号通路
G3P 直接靶向LCK 激酶结构域抑制其活性。Western blot 显示，G3P处理导致 LCK 磷酸化位点 Tyr394(激活型)减少、Tyr505(抑制型)增加(图 6a-b)，且呈剂量依赖性(200μM G3P 时 Tyr394 磷酸化水平下降 62%，P<0.001)。表面等离子共振(BIAcore)证实 G3P 与 LCK直接结合(KD=9.8×10⁻⁶M，图6d-e)，结合区域为 LCK 激酶域 AA330-509(图 6h-o)。
图 5 G3P 通过 LCK 信号抑制 CD8⁺T 细胞
a. TCR 信号通路。b. 与 shCtrl 或 shVcp Hepa1-6-OVA 细胞共培养的 CD8⁺T 细胞在激活5 或 10 分钟或未刺激(0)时的细胞裂解物通过蛋白质免疫印迹(WB)分析。c. 用 G3P 处理或未处理(对照)的小鼠 naive CD8⁺细胞在指定时间激活后的细胞裂解物通过蛋白质免疫印迹(WB)分析。d–g. 左图，用 G3P 处理或未处理(对照)的小鼠 naive CD8⁺T 细胞在刺激后进行免疫染色和共聚焦显微镜成像。右图，平均荧光强度定量。h. 在刺激期间用 G3P 和 / 或 PP2 处理的小鼠 CD8⁺T 细胞中所示蛋白质的免疫印迹分析。i. 通过流式细胞术测定用 G3P 和/ 或 PP2 处理的小鼠 CD8⁺T 细胞中激活标志物的表达(n=3)。j. 通过流式细胞术测量用G3P 和 / 或 PP2 处理的小鼠 CD8⁺T 细胞产生的细胞因子百分比(n=3)。k. 表达野生型 LCK 或 LCK (Y394F) 突变体的 Jurkat T 细胞用 G3P 处理或未处理。
分子对接显示 G3P 与 LCK 的 ATP 结合口袋附近氨基酸(如 R338、K336)形成氢键。LCK 抑制剂 PP2 可完全阻断 G3P 诱导的TCR 信号抑制(图 5h)，而 LCK (Y505F) 突变体对 G3P 不敏感(图 6c)。
图 6 G3P 直接与 LCK 相互作用并抑制其活性
a. 用梯度浓度的 G3P 处理的人 CD8⁺T 细胞的p-LCK (Y394) 水平。b. 用梯度浓度的 G3P 处理的人 CD8⁺T 细胞中所示蛋白质的免疫印迹分析。c. 使用纯化的 LCK 及其突变体与 ATP 和递增剂量的 G3P 孵育的体外激酶测定。d. 纯化的 LCK 蛋白通过 SDS-PAGE 分析，然后进行考马斯蓝染色。e. BIAcore 测量 G3P 与纯化的 LCK 之间的相互作用。f. 使用三维结构推测 LCK 与 G3P 的相互作用。g. LCK 结构示意图。h. 纯化的 LCK (60-240AAs) 区域通过 SDS-PAGE 分析，然后进行考马斯蓝染色。i. BIAcore 测量 G3P 与纯化的该区域的相互作用。j. 纯化的 LCK (240-509AAs) 区域通过 SDS-PAGE 分析，然后进行考马斯蓝染色。k. BIAcore 测量 G3P 与纯化的该区域的相互作用。l. 纯化的 LCK (230-390AAs) 区域通过 SDS-PAGE 分析，然后进行考马斯蓝染色。m. BIAcore 测量 G3P 与纯化的该区域的相互作用。n. 纯化的 LCK (330-509AAs) 区域通过 SDS-PAGE 分析，然后进行考马斯蓝染色。o. BIAcore 测量 G3P 与纯化的该区域的相互作用。
靶向VCP 联合抗 PD-1 显著增强抗肿瘤免疫
VCP 抑制剂与抗PD-1 联用可协同抑制肿瘤生长。C57BL/6 小鼠模型中，CB-5083(50mg/kg)+ 抗 PD-1 组肿瘤体积较单药组减少 68%(P<0.001，图 7b-c)，CD8+T 细胞浸润增加2.1 倍(P<0.01，图 7d)，效应分子 IFN-γ+ 细胞比例提升至 35.2%(P<0.001，图 7e)。肝特异性 VCP 敲除(Vcp²/²;Alb-Cre)小鼠联合治疗组生存期延长至 56 天(对照组 28 天，P<0.0001，图 7g-i)，肿瘤间质液 G3P 水平降低 51%(P<0.01)。多重免疫荧光显示，联合治疗组 CD8+T 细胞密度及颗粒酶 B 表达显著升高(图 7m)。
图 7 靶向 VCP 联合抗 PD-1 调节 HCC 的肿瘤微环境
a. 荷 Hepa1-6 肿瘤的 C57BL/6 小鼠的治疗方案示意图。b, c. 用载体、抗 PD-1、CB-5083或 CB-5083 + 抗 PD-1 治疗的荷 Hepa1-6 肿瘤的 C57BL/6 小鼠的肿瘤体积代表性图像和定量分析(每组 n=5)。d–f. 通过流式细胞术分析肿瘤中 CD8⁺T 细胞百分比(d)、细胞因子产生(e)和激活标志物(f)(每组 n=5)。g–i. Vcp²/²;Alb-Cre 和对照小鼠的自发 HCC 肿瘤体积(g)、生物发光信号(h)和生存曲线(i)(每组 n=10)。j–l. 通过流式细胞术分析 Vcp²/²;Alb-Cre 和对照小鼠肿瘤中 CD8⁺T 细胞百分比(j)、细胞因子产生(k)和激活标志物(l)(每组 n=5)。m. Vcp²/²;Alb-Cre 和对照小鼠肿瘤的多重免疫荧光染色代表性图像，显示 CD8α 和 GzmB(比例尺：40 μm)。n. 机制示意图：VCP 通过稳定 GPD1L 促进 G3P 积累，G3P结合 LCK 抑制 TCR 信号，联合治疗逆转该过程。
总结
本研究首次揭示 VCP-G3P-LCK 信号轴在肝癌免疫逃逸中的核心作用，将肿瘤代谢异常与 CD8+T细胞功能耗竭直接关联，为理解 TME 免疫抑制提供了新视角。研究不仅鉴定了 VCP 作为上游调控靶点的潜力，还通过联合抗 PD-1 治疗验证了代谢干预与免疫治疗的协同效应，为克服肝癌 ICB 耐药提供了 “代谢重编程 + 免疫激活” 的双重策略。
独特价值在于：① 突破传统代谢物(如乳酸)的研究框架，首次聚焦 G3P 的免疫调控功能;② 发现 VCP 通过稳定代谢酶而非直接参与信号通路发挥作用，拓展了肿瘤代谢 - 免疫互作的机制维度;③ 提出 “靶向 VCP + 抗 PD-1” 的联合疗法，为临床转化提供了可验证的组合策略。未来需进一步在更大临床队列及其他癌种中验证该机制，并开发高效低毒的 VCP 抑制剂，推动代谢免疫联合治疗的临床应用。
参考文献
Cheng C, Zha Q, Sun L, et al. VCP downstream metabolite glycerol-3-phosphate (G3P) inhibits CD8+ T cells function in the HCC microenvironment[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2025, 10(1): 26.
