基于单线态氧荧光传感的微流控光动力疗法研究

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1周前

上图（c）是细胞明场照片与638~680nm激发光下红色荧光照片的叠加图像，可以清楚地观察到ZnPc的红色荧光（发射波长为675nm）与细胞重合，说明细胞可高效吞噬ZnPc纳米粒子。

癌症因其居高不下的年新增病例数量与死亡病例数量，目前依旧严重威胁着人类的生命健康。传统治疗癌症的方式存在明显的局限性，其副作用与并发症更是大大提高了癌症治疗的门槛。光动力疗法（PDT）不仅具有副作用小的优势，且对于癌症晚期阶段也具有一定的治疗效果，因此在肿瘤治疗的相关生物医学领域具有重要的意义。

光敏剂、光源、氧气是PDT三要素。当光敏剂吸收特定波长光子时，光敏剂会从基态被激活到激发态，其直接与分子氧相互作用形成单线态氧（Singlet oxygen，¹O₂），进而杀死肿瘤细胞。经过几十年的发展，光敏剂数次迭代更新，尤其是纳米技术的进步使得光敏剂的靶向性、治疗效果大幅提升。例如，金纳米笼搭载无机材料、过氧化氢酶来缓解肿瘤中的乏氧问题，上转换纳米颗粒通过反斯托克斯发射过程来解决PDT光源穿深问题，纳米金属有机骨架材料用于克服荧光猝灭效应。

尽管在光敏剂方面已经取得很大进展，但由于肿瘤微环境的复杂性使得目前肿瘤PDT的临床推广依旧困难重重。其一，肿瘤微环境的组织乏氧、微酸化、弱还原性等特点，抑制了PDT中活性氧的毒性，进而降低了肿瘤治疗效果。对应的策略多是将PDT与光热疗法、化学动力疗法、免疫疗法等进行联合，通过多模式疗法来提高肿瘤治疗效果。其二，通常的PDT方案是基于体外静态培养的二维肿瘤细胞进行筛选，其与人体内实体瘤环境差异巨大，使得PDT的实体肿瘤治疗效果不佳。

微技术的高速发展使其有望成为一个能高效、高实用性、高准确度的复现人体肿瘤微环境的工具。这一技术经过十数年的发展，已经在PDT的各个方向取得相当喜人的成果。例如，有研究人员构建了一种单次实验可以得到包含氧气、光敏剂、光强度多种实验数据的多功能芯片实验平台来进行高通量药物筛选；已有报道利用微流控芯片进行血管重建来研究中性粒细胞的外渗；此外，还有研究构建了一种血管-肿瘤微流控模型来研究多功能纳米颗粒对免疫细胞的招募能力。

因此，利用微流控技术使得细胞的体外培养环境能够更加接近人体内肿瘤微环境，对于推进PDT在临床上的应用具有重要意义。但由于微流控芯片结构的特殊性与细胞培养的轻量化，对微流控芯片的相关研究难以使用酶标仪、细胞流式术等常规方式进行表征，而通过荧光传感对光动力治疗过程中产生的单线态氧进行实时监测，为在微流控芯片上对PDT疗效进行评估提供了一种新的思路。

据麦姆斯咨询介绍，中央民族大学理学院的研究人员设计并开发了一种微流控生物芯片用于肿瘤PDT。相关研究成果以“基于单线态氧荧光传感的微流控光动力疗法研究”为题发表于《发光学报》。研究人员首先利用再沉淀-包覆法制备了负载酞菁锌（ZnPc）的纳米光敏剂以及负载1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）的单线态氧荧光纳米传感器；然后设计并制作微流控生物芯片，在其中完成细胞的培养与纳米粒子的装载；最后通过调控微流控参数研究微酸化和力学微环境对ZnPc纳米粒子的吞噬效率以及PDT功效的影响，并利用DPBF纳米粒子对PDT过程中单线态氧的产生进行实时传感，研究影响单线态氧产率的主要因素。

微流控生物芯片：（a）掩模版设计图，（b）结构示意图，（c）微流控芯片实物照片，（d）功能验证图片。左右两通道分别注入红蓝墨水（注入流量为100 μL/s），中间通道不做处理。

微流控芯片培养室内未吞噬（a）和吞噬ZnPc纳米粒子（b）的Hela细胞的明场照片，以及与其共聚焦荧光图像（λex= 638 nm，λem= 665~705 nm）的叠加图（c）。同时吞噬ZnPc和DPBF纳米粒子的Hela细胞共聚焦荧光照片：（d）λex= 638 nm，λem= 665~705 nm；（e）λex= 405 nm，λem= 440-500 nm；（f）图像叠加。

利用微流控芯片培养Hela细胞，用共聚焦显微镜对两种纳米粒子的吞噬效果进行研究。上图（a）、（b）分别是正常培养在微流控芯片中的Hela细胞在吞噬纳米粒子前后的明场成像。可以观察到Hela细胞在培养室的表面可以贴壁生长，形态良好；负载纳米粒子后的细胞形貌基本没有发生变化，说明ZnPc纳米粒子具有良好的生物兼容性。上图（c）是细胞明场照片与638~680 nm激发光下红色荧光照片的叠加图像，可以清楚地观察到ZnPc的红色荧光（发射波长为675 nm）与细胞重合，说明细胞可高效吞噬ZnPc纳米粒子。将Hela细胞与ZnPc纳米粒子及DPBF纳米粒子共孵育，其荧光成像照片如上图（d）~（f）所示。从图中可以看到两种纳米粒子的荧光分布位置基本一致，说明大部分肿瘤细胞可同时吞噬ZnPc和DPBF纳米粒子。考虑到单线态氧的短寿命（约10~100 ns）和短的扩散半径（~10 nm），两种纳米粒子在细胞内的共定位可以保证对PDT产生单线态氧的实时、快速响应，为后续PDT实验奠定了良好的基础。

不同注射流量（上）和pH值（下）对Hela细胞PDT疗效的影响。绿色荧光 λex= 488 nm，采集范围500~550 nm；红色荧光 λex=525 nm，采集范围581~654 nm。

结果表明，肿瘤细胞对ZnPc纳米粒子的吞噬效率随着环境酸化以及剪切应力的增加而单调减弱，但是PDT功效与微环境参量的关系则较为复杂。在PDT初期，较高水平的氧含量可产生大量单线态氧，微酸化和力学微环境的差异对光毒性影响不大，在30 s内荧光强度均下降40%左右；PDT后期氧含量下降，单线态氧产率下降，且因肿瘤微环境参量的不同而产生不同的光毒性。该工作提供了一种模拟人体肿瘤微环境的工具与思路，为推进PDT在癌症治疗方面的发展提供了有益的参考。

论文信息：

DOI：10.37188/CJL.20240145

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