豇豆（Vigna unguiculataL.Walp.）作为一种耐高温、抗干旱的豆科植物，广泛种植于全球热带和亚热带地区，如亚洲、非洲和美洲等。它不仅具有高营养价值，提供丰富的蛋白质、维生素和微量元素，还具有显著的药用价值。豇豆不仅是营养的来源，也是促进可持续农业和改善公共健康的重要作物。但是豇豆的生产常常受到多种生物胁迫的影响，其中豇豆花叶病毒（Cowpea mosaic virus, CPMV）是最具破坏性的病毒之一。CPMV能够引起植物的黄化病斑，严重影响作物产量和质量。因此，了解植物如何识别和抵御这种病毒，对于提高作物的抗病性至关重要。然而，目前关于豇豆花叶病毒与植物的互作研究的进展非常有限。

豇豆花叶病毒CPMV编码的半胱氨酸蛋白酶24KPro不仅介导病毒寡聚蛋白的剪切以促进病毒的成熟组装，同时还作为病毒效应子触发植物的免疫反应。因此，该研究以24KPro为切入点，利用酵母双杂交筛选豇豆cDNA文库以及免疫沉淀-质谱法（IP-MS）筛选到了12个候选互作蛋白，后续通过多种生化手段发现豇豆LTP1能够与24KPro互作并且两者之间的相互作用依赖于24KPro的半胱氨酸蛋白酶活性。进一步通过基因功能验证，发现CPMV侵染豇豆叶片后LTP1被显著诱导表达，在烟草和豇豆中过表达LTP1能够显著抑制叶片中CPMV的积累，而沉默LTP1表达则会导致病毒在豇豆叶片中的积累量显著增加。这些结果说明LTP1在豇豆的CPMV抗性调节中发挥了关键作用。

对LTP1的功能机制进行解析，发现在健康的植物细胞中LTP1通过内质网和高尔基体介导的分泌途径定位于质外体，在此过程中LTP1的信号肽被切割。CPMV感染植物细胞后，豇豆LTP1的蛋白定位改变，主要富集在细胞质和叶绿体。在胞质中，LTP1与CPMV 24KPro存在共定位，进一步的蛋白酶活性实验表明LTP1能够直接与24KPro相互作用并抑制其蛋白酶活性，从而阻碍CPMV在植物中的繁殖，促进植物的CPMV抗性。

此外，研究还发现过表达豇豆LTP1的转基因烟草对于大豆花叶病毒SMV的抗性明显增强，SMV编码与24KPro类似的3CL-Pro NIa，豇豆LTP1同样可以显著抑制NIa的半胱氨酸蛋白酶活性。因此，豇豆LTP1可能作为一种半胱氨酸蛋白酶的光谱抑制剂，在植物病毒抗性育种方面有潜在用途。

华中农业大学生命科学技术学院已毕业博士季捷（现为生科院博士后）为论文的第一作者，樊秋玲副教授为论文的通讯作者。华中农业大学生命科学技术学院端木德强教授、华中农业大学园艺林学学院王鹏蔚教授、加州大学戴维斯分校George Bruening教授等也参与了本项研究。该研究得到国家自然科学基金和华中农业大学生命科学技术学院龙云计划的支持。

【英文摘要】

Many virus genomes encode proteases that facilitate infection. The molecular mechanism of plant recognition of viral proteases is largely unexplored. Using the system ofVigna unguiculataand cowpea mosaic virus （CPMV）， we identified a cowpea lipid transfer protein （LTP1） which interacts with CPMV-encoded 24KPro, a cysteine protease, but not with the enzymatically inactive mutant 24KPro（C166A）。 Biochemical assays showed that LTP1 inhibited 24KPro proteolytic cleavage of the coat protein precursor LCP-sCP. Transient overexpression of LTP1 in cowpea reduced CPMV infection, whereas RNAi-mediatedLTP1silencing increased CPMV accumulation in cowpea. LTP1 is mainly localized in the apoplast of uninfected plant cells, and after CPMV infection, most of the LTP1 is relocated to intracellular compartments, including chloroplast. Moreover, in stableLTP1-transgenicN. benthamianaplants,LTP1 repressed SMV NIa protease activity and accumulation of soybean mosaic virus （SMV） was significantly reduced. We propose that cowpea LTP1 suppresses CPMV and SMV accumulation by directly inhibiting viral cysteine protease activity.

论文链接： https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2403424121

豇豆（Vigna unguiculataL.Walp.）作为一种耐高温、抗干旱的豆科植物，广泛种植于全球热带和亚热带地区，如亚洲、非洲和美洲等。它不仅具有高营养价值，提供丰富的蛋白质、维生素和微量元素，还具有显著的药用价值。豇豆不仅是营养的来源，也是促进可持续农业和改善公共健康的重要作物。但是豇豆的生产常常受到多种生物胁迫的影响，其中豇豆花叶病毒（Cowpea mosaic virus, CPMV）是最具破坏性的病毒之一。CPMV能够引起植物的黄化病斑，严重影响作物产量和质量。因此，了解植物如何识别和抵御这种病毒，对于提高作物的抗病性至关重要。然而，目前关于豇豆花叶病毒与植物的互作研究的进展非常有限。

豇豆花叶病毒CPMV编码的半胱氨酸蛋白酶24KPro不仅介导病毒寡聚蛋白的剪切以促进病毒的成熟组装，同时还作为病毒效应子触发植物的免疫反应。因此，该研究以24KPro为切入点，利用酵母双杂交筛选豇豆cDNA文库以及免疫沉淀-质谱法（IP-MS）筛选到了12个候选互作蛋白，后续通过多种生化手段发现豇豆LTP1能够与24KPro互作并且两者之间的相互作用依赖于24KPro的半胱氨酸蛋白酶活性。进一步通过基因功能验证，发现CPMV侵染豇豆叶片后LTP1被显著诱导表达，在烟草和豇豆中过表达LTP1能够显著抑制叶片中CPMV的积累，而沉默LTP1表达则会导致病毒在豇豆叶片中的积累量显著增加。这些结果说明LTP1在豇豆的CPMV抗性调节中发挥了关键作用。

对LTP1的功能机制进行解析，发现在健康的植物细胞中LTP1通过内质网和高尔基体介导的分泌途径定位于质外体，在此过程中LTP1的信号肽被切割。CPMV感染植物细胞后，豇豆LTP1的蛋白定位改变，主要富集在细胞质和叶绿体。在胞质中，LTP1与CPMV 24KPro存在共定位，进一步的蛋白酶活性实验表明LTP1能够直接与24KPro相互作用并抑制其蛋白酶活性，从而阻碍CPMV在植物中的繁殖，促进植物的CPMV抗性。

此外，研究还发现过表达豇豆LTP1的转基因烟草对于大豆花叶病毒SMV的抗性明显增强，SMV编码与24KPro类似的3CL-Pro NIa，豇豆LTP1同样可以显著抑制NIa的半胱氨酸蛋白酶活性。因此，豇豆LTP1可能作为一种半胱氨酸蛋白酶的光谱抑制剂，在植物病毒抗性育种方面有潜在用途。

华中农业大学生命科学技术学院已毕业博士季捷（现为生科院博士后）为论文的第一作者，樊秋玲副教授为论文的通讯作者。华中农业大学生命科学技术学院端木德强教授、华中农业大学园艺林学学院王鹏蔚教授、加州大学戴维斯分校George Bruening教授等也参与了本项研究。该研究得到国家自然科学基金和华中农业大学生命科学技术学院龙云计划的支持。

【英文摘要】

Many virus genomes encode proteases that facilitate infection. The molecular mechanism of plant recognition of viral proteases is largely unexplored. Using the system ofVigna unguiculataand cowpea mosaic virus （CPMV）， we identified a cowpea lipid transfer protein （LTP1） which interacts with CPMV-encoded 24KPro, a cysteine protease, but not with the enzymatically inactive mutant 24KPro（C166A）。 Biochemical assays showed that LTP1 inhibited 24KPro proteolytic cleavage of the coat protein precursor LCP-sCP. Transient overexpression of LTP1 in cowpea reduced CPMV infection, whereas RNAi-mediatedLTP1silencing increased CPMV accumulation in cowpea. LTP1 is mainly localized in the apoplast of uninfected plant cells, and after CPMV infection, most of the LTP1 is relocated to intracellular compartments, including chloroplast. Moreover, in stableLTP1-transgenicN. benthamianaplants,LTP1 repressed SMV NIa protease activity and accumulation of soybean mosaic virus （SMV） was significantly reduced. We propose that cowpea LTP1 suppresses CPMV and SMV accumulation by directly inhibiting viral cysteine protease activity.

论文链接： https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2403424121