研究背景
克罗恩病(CD)是一种慢性复发性炎症性肠病(IBD)，以胃肠道透壁性炎症为主要特征，病变可累及从口腔至肛门的任何肠段，但末端回肠受累尤为常见。该病的临床表现和治疗反应具有显著的个体异质性，尽管抗肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-12(IL-12)和IL-23等靶向生物制剂已显著改善了部分患者的临床结局，但仍有相当比例的患者存在原发性无应答或继发性失应答，约15%的患者在确诊后五年内需要接受外科手术治疗。因此，深入阐明CD的发病分子机制、拓展治疗靶点仍是该领域亟待解决的核心问题。
单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术为在单细胞分辨率下解析复杂组织的细胞组成与基因表达特征提供了高通量手段。既往研究虽已利用scRNA-seq在IBD领域取得若干重要发现，包括溃疡性结肠炎中基质细胞的重塑、CD8+T细胞的病理改变、BEST4+肠上皮细胞的鉴定以及IBD中化生细胞的发现等，但受限于样本量偏小，这些研究在统计效能和结果可重复性方面均面临挑战。2026年6月15日，Nature Genetics杂志在线发表了一篇题为“Single-cell RNA sequencing of terminal ileal biopsies identifies signatures of Crohn's disease pathogenesis”的文章，研究团队构建了迄今规模较大的末端回肠单细胞转录组数据资源IBDverse，通过发现队列与验证队列的双队列设计，系统揭示了CD相关的细胞类型、差异表达基因及信号通路，为理解CD的分子病理机制和治疗靶点开发提供了重要框架。
研究方法
本研究是一项基于scRNA-seq技术的观察性横断面研究，旨在通过大规模单细胞转录组分析，系统描绘CD患者末端回肠的细胞图谱，识别与疾病相关的细胞类型、差异表达基因及生物学通路，并整合遗传学数据探讨疾病易感性与特定细胞类型的关联。
研究共纳入343例受试者，其中CD患者111例(包括64例内镜下活动期炎症患者和47例非活动期患者)，健康对照232例。所有样本经随机分配进入发现队列(57例CD患者和114例健康对照)和验证队列(54例CD患者和118例健康对照)。活检标本采用标准化流程进行单细胞解离：首先在含地衣芽孢杆菌蛋白酶的Hank平衡盐溶液中于冰上机械切碎并孵育30分钟，随后经胶原酶Ⅳ和DNA酶I短暂消化，红细胞裂解后过滤获得单细胞悬液，使用Chromium 10x 3'试剂盒进行scRNA-seq文库构建。CD患者样本目标捕获6000个细胞，健康对照样本目标捕获3000个细胞，测序深度为每细胞50000条读数。此外，研究还利用来自3名健康对照和4例CD患者的肠道类器官模型，经重组人IFNγ(10 μg/ml)刺激5天以模拟慢性炎症状态，进行独立的机制验证实验。
研究结果
▌末端回肠细胞图谱的构建与CD相关细胞类型富集
研究在图谱队列(35例CD和35例健康对照)中鉴定出57个独特的细胞簇，涵盖上皮细胞(干细胞、肠吸收细胞和分泌细胞)、免疫细胞(T细胞、B细胞、浆B细胞和髓系细胞)及间充质细胞三大类群。通过训练CellTypist分类模型，对全部343例样本的超过110万个细胞进行了自动注释。
在全队列差异丰度分析中，13种细胞类型在CD中显著富集(FDR<0.05，且在两队列中方向一致)，其中S100A8/9⁺单核细胞和CXCL9/CXCL10⁺巨噬细胞在健康对照的髓系细胞中几乎检测不到(占比<2%)，而在CD炎症状态下分别占髓系细胞的25%和7%，提示这些细胞是肠道炎症的关键参与者。此外，研究还鉴定出CD特异性的肠上皮细胞亚群，包括GPX2⁺祖细胞和IFI27⁺绒毛细胞，其转录特征提示屏障应答和抗菌活性增强。
▌差异基因表达的可重复性分析
研究采用混合模型(MAST)对CD活动期与对照组进行差异基因表达分析。在全队列中，共鉴定出5385个差异表达基因，其中分泌型上皮细胞、肠吸收细胞和T细胞的差异表达基因数量最多(分别为6527、6324和4866个)，而浆B细胞尽管测序细胞数超过70000个，差异表达基因仅719个。值得注意的是，发现队列中仅44%的差异表达基因在验证队列中以相同方向和显著性水平(FDR<0.05)得到重复，提示scRNA-seq差异表达分析在复杂疾病队列中面临可重复性挑战。不同细胞类型的fold change可重复性差异显著：上皮细胞差异表达基因的可重复性较高(平均PearsonR≥0.74)，而浆B细胞较低(平均R=0.56，图1);在免疫细胞中，γδ T细胞的可重复性(R=0.82)显著优于LEF1⁺ T细胞(R=0.28)和组织驻留CD8⁺ T细胞(R=0.32)。
图1 发现队列与验证队列差异表达基因log₂的相关性分析
▌上皮细胞的泛上皮干扰素应答与MHC-I持续上调
基因集富集分析显示，在CD活动期，12种上皮细胞类型沿隐窝-绒毛轴呈现I型干扰素(IFNα/β)信号通路的显著上调，前缘基因包括IFI27、HLA-A/B/C/E/F、IFITM3、PSMB8、STAT1和IRF1。这些基因同时富集于抗原加工与交叉呈递、MHC-I折叠组装与肽加载、内质网吞噬体通路和内体空泡通路等多个通路。尤为重要的是，MHC-I相关通路的富集程度与内镜炎症评分(TI-SES-CD)呈剂量依赖关系，且在CD非活动期患者的活检中，MHC-I抗原加工与呈递通路的富集仍然持续存在，特别是在OLFM4⁺祖细胞和MKI67⁺干细胞等前体细胞中。类器官验证实验进一步证实，IFNγ刺激可诱导上皮细胞中IFNγ信号和MHC-I抗原加工通路上调，且部分MHC-I通路元素在未刺激类器官中亦呈弱富集，提示该抗原呈递程序可在炎症微环境之外持续存在。
▌ITGA4⁺巨噬细胞作为关键炎症驱动细胞
ITGA4(整合素α4，CD49d)是IBD治疗药物维得利珠单抗的靶点。研究发现，ITGA4在两种髓系细胞群中表达最高：ITGA4⁺巨噬细胞和CD163⁺⁺巨噬细胞。ITGA4⁺巨噬细胞在CD炎症期显著扩增(占髓系细胞的比例从健康对照的约10%升至活动期的约16%)，且其差异表达基因的可重复性在所有细胞类型中最高(PearsonR=0.88)。
基因集富集分析揭示ITGA4⁺巨噬细胞富集于9条细胞因子信号通路，包括IL-6、IL-12和IL-23等通路，提示其主要通过IL-6和干扰素超家族受体信号传导，介导JAK1、JAK2和TYK2的激活。JAK2和STAT1是该细胞类型中过表达最显著的基因，同时伴随负调控因子PTPN1/2的表达上调。IL-10、IL-12和IL-20的表达水平与内镜炎症评分(TI-SES-CD)呈正相关。此外，ITGA4⁺巨噬细胞还上调了蛋白酶体(PSMA4/5)和免疫蛋白酶体(PSMB8/9)相关基因，提示其在MHC-I介导的CD8⁺T细胞抗原呈递中发挥主动作用。
▌遗传易感性与细胞类型的关联
研究利用分层连锁不平衡评分回归分析了57种细胞类型的特异性表达基因与CD、溃疡性结肠炎及IBD遗传关联信号的富集关系。结果显示，仅免疫细胞类型表现出CD、溃疡性结肠炎和IBD遗传力的显著富集。在先天免疫细胞中，S100A8/9⁺单核细胞、SOD2⁺单核细胞、CXCL9/CXCL10⁺巨噬细胞、CD163⁺/⁺⁺巨噬细胞和1型常规树突状细胞的特异性表达基因显著富集于CD遗传力(家族错误率<5%)。
在适应性免疫compartment中，CD4⁺CXCR6⁺记忆T细胞、调节性T细胞、TRGC2⁺CD8⁺T细胞和CD4⁻CD8⁻T细胞的特异性表达基因同时富集于CD和溃疡性结肠炎遗传力，而CD8⁺组织驻留T细胞和γδ T细胞则特异性富集于CD遗传力。
总结
本研究通过迄今规模较大的末端回肠单细胞转录组队列IBDverse，首次在成人克罗恩病中系统揭示了炎症消退后肠上皮前体细胞中MHC-I抗原呈递程序的持续存在，这一“分子疤痕”现象解释了临床缓解与分子修复之间的脱节;同时锁定ITGA4⁺巨噬细胞作为JAK-STAT信号及IL-6、IL-12、IL-23等细胞因子的核心驱动者，并通过遗传力富集分析将S100A8/9⁺单核细胞、CXCL9/CXCL10⁺巨噬细胞等先天免疫细胞与疾病易感性直接关联。这些发现不仅为现有靶向药物的作用机制提供了细胞水平的精准注释，更从“临床缓解”向“分子治愈”的跨越中，开辟了针对上皮免疫记忆和巨噬细胞亚群的新型干预策略与生物标志物开发方向。
参考文献
KRZAK M, ALEGBE T, TAYLOR DL,et al. Single-cell RNA sequencing of terminal ileal biopsies identifies signatures of Crohn's disease pathogenesis[J]. Nat Genet,2026;58(7):1610-1619.DOI:10.1038/s41588-026-02634-7.
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编辑：薄荷
审核：梨九
排版：蓝桉
封面图源：由AI生成
研究背景
克罗恩病(CD)是一种慢性复发性炎症性肠病(IBD)，以胃肠道透壁性炎症为主要特征，病变可累及从口腔至肛门的任何肠段，但末端回肠受累尤为常见。该病的临床表现和治疗反应具有显著的个体异质性，尽管抗肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-12(IL-12)和IL-23等靶向生物制剂已显著改善了部分患者的临床结局，但仍有相当比例的患者存在原发性无应答或继发性失应答，约15%的患者在确诊后五年内需要接受外科手术治疗。因此，深入阐明CD的发病分子机制、拓展治疗靶点仍是该领域亟待解决的核心问题。
单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术为在单细胞分辨率下解析复杂组织的细胞组成与基因表达特征提供了高通量手段。既往研究虽已利用scRNA-seq在IBD领域取得若干重要发现，包括溃疡性结肠炎中基质细胞的重塑、CD8+T细胞的病理改变、BEST4+肠上皮细胞的鉴定以及IBD中化生细胞的发现等，但受限于样本量偏小，这些研究在统计效能和结果可重复性方面均面临挑战。2026年6月15日，Nature Genetics杂志在线发表了一篇题为“Single-cell RNA sequencing of terminal ileal biopsies identifies signatures of Crohn's disease pathogenesis”的文章，研究团队构建了迄今规模较大的末端回肠单细胞转录组数据资源IBDverse，通过发现队列与验证队列的双队列设计，系统揭示了CD相关的细胞类型、差异表达基因及信号通路，为理解CD的分子病理机制和治疗靶点开发提供了重要框架。
研究方法
本研究是一项基于scRNA-seq技术的观察性横断面研究，旨在通过大规模单细胞转录组分析，系统描绘CD患者末端回肠的细胞图谱，识别与疾病相关的细胞类型、差异表达基因及生物学通路，并整合遗传学数据探讨疾病易感性与特定细胞类型的关联。
研究共纳入343例受试者，其中CD患者111例(包括64例内镜下活动期炎症患者和47例非活动期患者)，健康对照232例。所有样本经随机分配进入发现队列(57例CD患者和114例健康对照)和验证队列(54例CD患者和118例健康对照)。活检标本采用标准化流程进行单细胞解离：首先在含地衣芽孢杆菌蛋白酶的Hank平衡盐溶液中于冰上机械切碎并孵育30分钟，随后经胶原酶Ⅳ和DNA酶I短暂消化，红细胞裂解后过滤获得单细胞悬液，使用Chromium 10x 3'试剂盒进行scRNA-seq文库构建。CD患者样本目标捕获6000个细胞，健康对照样本目标捕获3000个细胞，测序深度为每细胞50000条读数。此外，研究还利用来自3名健康对照和4例CD患者的肠道类器官模型，经重组人IFNγ(10 μg/ml)刺激5天以模拟慢性炎症状态，进行独立的机制验证实验。
研究结果
▌末端回肠细胞图谱的构建与CD相关细胞类型富集
研究在图谱队列(35例CD和35例健康对照)中鉴定出57个独特的细胞簇，涵盖上皮细胞(干细胞、肠吸收细胞和分泌细胞)、免疫细胞(T细胞、B细胞、浆B细胞和髓系细胞)及间充质细胞三大类群。通过训练CellTypist分类模型，对全部343例样本的超过110万个细胞进行了自动注释。
在全队列差异丰度分析中，13种细胞类型在CD中显著富集(FDR<0.05，且在两队列中方向一致)，其中S100A8/9⁺单核细胞和CXCL9/CXCL10⁺巨噬细胞在健康对照的髓系细胞中几乎检测不到(占比<2%)，而在CD炎症状态下分别占髓系细胞的25%和7%，提示这些细胞是肠道炎症的关键参与者。此外，研究还鉴定出CD特异性的肠上皮细胞亚群，包括GPX2⁺祖细胞和IFI27⁺绒毛细胞，其转录特征提示屏障应答和抗菌活性增强。
▌差异基因表达的可重复性分析
研究采用混合模型(MAST)对CD活动期与对照组进行差异基因表达分析。在全队列中，共鉴定出5385个差异表达基因，其中分泌型上皮细胞、肠吸收细胞和T细胞的差异表达基因数量最多(分别为6527、6324和4866个)，而浆B细胞尽管测序细胞数超过70000个，差异表达基因仅719个。值得注意的是，发现队列中仅44%的差异表达基因在验证队列中以相同方向和显著性水平(FDR<0.05)得到重复，提示scRNA-seq差异表达分析在复杂疾病队列中面临可重复性挑战。不同细胞类型的fold change可重复性差异显著：上皮细胞差异表达基因的可重复性较高(平均PearsonR≥0.74)，而浆B细胞较低(平均R=0.56，图1);在免疫细胞中，γδ T细胞的可重复性(R=0.82)显著优于LEF1⁺ T细胞(R=0.28)和组织驻留CD8⁺ T细胞(R=0.32)。
图1 发现队列与验证队列差异表达基因log₂的相关性分析
▌上皮细胞的泛上皮干扰素应答与MHC-I持续上调
基因集富集分析显示，在CD活动期，12种上皮细胞类型沿隐窝-绒毛轴呈现I型干扰素(IFNα/β)信号通路的显著上调，前缘基因包括IFI27、HLA-A/B/C/E/F、IFITM3、PSMB8、STAT1和IRF1。这些基因同时富集于抗原加工与交叉呈递、MHC-I折叠组装与肽加载、内质网吞噬体通路和内体空泡通路等多个通路。尤为重要的是，MHC-I相关通路的富集程度与内镜炎症评分(TI-SES-CD)呈剂量依赖关系，且在CD非活动期患者的活检中，MHC-I抗原加工与呈递通路的富集仍然持续存在，特别是在OLFM4⁺祖细胞和MKI67⁺干细胞等前体细胞中。类器官验证实验进一步证实，IFNγ刺激可诱导上皮细胞中IFNγ信号和MHC-I抗原加工通路上调，且部分MHC-I通路元素在未刺激类器官中亦呈弱富集，提示该抗原呈递程序可在炎症微环境之外持续存在。
▌ITGA4⁺巨噬细胞作为关键炎症驱动细胞
ITGA4(整合素α4，CD49d)是IBD治疗药物维得利珠单抗的靶点。研究发现，ITGA4在两种髓系细胞群中表达最高：ITGA4⁺巨噬细胞和CD163⁺⁺巨噬细胞。ITGA4⁺巨噬细胞在CD炎症期显著扩增(占髓系细胞的比例从健康对照的约10%升至活动期的约16%)，且其差异表达基因的可重复性在所有细胞类型中最高(PearsonR=0.88)。
基因集富集分析揭示ITGA4⁺巨噬细胞富集于9条细胞因子信号通路，包括IL-6、IL-12和IL-23等通路，提示其主要通过IL-6和干扰素超家族受体信号传导，介导JAK1、JAK2和TYK2的激活。JAK2和STAT1是该细胞类型中过表达最显著的基因，同时伴随负调控因子PTPN1/2的表达上调。IL-10、IL-12和IL-20的表达水平与内镜炎症评分(TI-SES-CD)呈正相关。此外，ITGA4⁺巨噬细胞还上调了蛋白酶体(PSMA4/5)和免疫蛋白酶体(PSMB8/9)相关基因，提示其在MHC-I介导的CD8⁺T细胞抗原呈递中发挥主动作用。
▌遗传易感性与细胞类型的关联
研究利用分层连锁不平衡评分回归分析了57种细胞类型的特异性表达基因与CD、溃疡性结肠炎及IBD遗传关联信号的富集关系。结果显示，仅免疫细胞类型表现出CD、溃疡性结肠炎和IBD遗传力的显著富集。在先天免疫细胞中，S100A8/9⁺单核细胞、SOD2⁺单核细胞、CXCL9/CXCL10⁺巨噬细胞、CD163⁺/⁺⁺巨噬细胞和1型常规树突状细胞的特异性表达基因显著富集于CD遗传力(家族错误率<5%)。
在适应性免疫compartment中，CD4⁺CXCR6⁺记忆T细胞、调节性T细胞、TRGC2⁺CD8⁺T细胞和CD4⁻CD8⁻T细胞的特异性表达基因同时富集于CD和溃疡性结肠炎遗传力，而CD8⁺组织驻留T细胞和γδ T细胞则特异性富集于CD遗传力。
总结
本研究通过迄今规模较大的末端回肠单细胞转录组队列IBDverse，首次在成人克罗恩病中系统揭示了炎症消退后肠上皮前体细胞中MHC-I抗原呈递程序的持续存在，这一“分子疤痕”现象解释了临床缓解与分子修复之间的脱节;同时锁定ITGA4⁺巨噬细胞作为JAK-STAT信号及IL-6、IL-12、IL-23等细胞因子的核心驱动者，并通过遗传力富集分析将S100A8/9⁺单核细胞、CXCL9/CXCL10⁺巨噬细胞等先天免疫细胞与疾病易感性直接关联。这些发现不仅为现有靶向药物的作用机制提供了细胞水平的精准注释，更从“临床缓解”向“分子治愈”的跨越中，开辟了针对上皮免疫记忆和巨噬细胞亚群的新型干预策略与生物标志物开发方向。
参考文献
KRZAK M, ALEGBE T, TAYLOR DL,et al. Single-cell RNA sequencing of terminal ileal biopsies identifies signatures of Crohn's disease pathogenesis[J]. Nat Genet,2026;58(7):1610-1619.DOI:10.1038/s41588-026-02634-7.
ldquo;医学论坛网”发布医学领域研究成果和解读，供专业人员科研参考，不作为诊疗标准，使用需根据具体情况评估。
编辑：薄荷
审核：梨九
排版：蓝桉
封面图源：由AI生成
