导语：慢性髓性白血病(CML)作为一种髓增殖性肿瘤，费城染色体导致的BCR::ABL1融合基因是其关键致病因素。酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的问世，显著改善了慢性期CML患者的预后，如今治疗目标已转变为TKI停药和无治疗缓解。然而，在尝试TKI停药的患者中，仅有38%-64%能够维持无治疗缓解，这是因为体内残留的白血病干细胞(LSCs)对TKI治疗具有耐受性，成为疾病进展和复发的隐患。
慢性髓性白血病治疗遇瓶颈?NK细胞疗法或成新希望
在CML治疗的艰难征程中，自然杀伤(NK)细胞免疫疗法崭露头角，为患者带来了新的希望。NK细胞作为先天免疫细胞，能够识别并杀伤病毒感染细胞和恶性细胞。多项研究表明，NK细胞在CML患者的治疗中意义重大，较高比例的成熟NK细胞与TKI停药的成功密切相关 。不过，TKIs与NK细胞功能之间存在复杂的相互作用，其对NK细胞既有增强作用，也有抑制作用，这无疑增加了治疗的复杂性。
此外，小分子药物在增强NK细胞毒性方面具有潜在价值，但此前相关研究较少。2025年4月，Blood杂志发表了一篇题为“High-throughput drug screening identifies SMAC mimetics as enhancers of NK-cell cytotoxicity in chronic myeloid leukemia”的文章，该研究旨在探索影响NK细胞对CML细胞毒性的药物类别，为未来免疫治疗奠定基础，这在CML治疗领域具有重要的开创性意义。
如何筛选增效药物?高通量筛选联合多实验探究
本研究是一项多方法联合的实验研究，旨在通过高通量药物筛选，识别能够影响NK细胞对CML细胞毒性的药物，并深入探究其作用机制。
在样本纳入筛选方面，研究使用了K562-luc细胞系以及来自健康供体的NK细胞。同时，还纳入了慢性期(CP)和急性期(BP)的CML患者的样本，以及健康供体的骨髓CD34细胞作为对照，确保样本的多样性和代表性。
实验分组上，设置了多种不同的组合。在NK细胞共培养药物敏感性筛选实验中，将K562-luc细胞与NK细胞共培养，并暴露于包含527种研究和已批准的肿瘤药物的文库中;在验证筛选实验中，使用定制药物板对选定药物进行重复实验;在NK细胞单独筛选实验中，则不添加靶细胞，单独检测药物对NK细胞活力的影响。此外，还有基于流式细胞术的原发性CML细胞毒性实验、集落形成实验以及患者NK细胞实验等，每个实验都根据研究目的进行了细致的分组。
干预措施主要是让细胞暴露于不同的药物中，观察细胞的反应。主要评价指标包括药物敏感性评分(DSSs)、细胞活力、细胞毒性、集落形成能力等;次要评价指标则通过单细胞RNA测序来分析药物诱导的转录组变化，以深入了解药物的作用机制。通过这些精心设计的实验分组和评价指标，全面系统地探究药物对NK细胞功能的影响。
SMAC模拟物能否增效?实验数据给出肯定答案
AC模拟物增强NK细胞毒性，部分药物起抑制作用
在高通量药物筛选实验中，研究人员对527种药物进行测试(图1C、D)。以差异药物敏感性评分(dDSS)为指标，设定dDSS>7.5为增强作用，dDSS<-7.5为抑制作用。结果显示，36种药物对NK细胞毒性有抑制作用，4种药物有增强作用 。其中，SMAC模拟物NVP-LCL161和birinapant是NK细胞毒性的强效增强剂(图2A)，在细胞系和原发性患者样本实验中均得到验证。
图1. 高通量药物筛选鉴定调节NK细胞细胞毒性的药物注：A. 高通量共培养药物敏感性和耐药性测试(DSRT)示意图。B. K562-luc细胞在与NK细胞以不同效应细胞与靶细胞(E:T)比例共培养4小时或24小时后的活力，其中柱状图表示标准差，点表示每种条件下的6个技术重复。C. 化合物库中主要药物类别的概述。D. 24小时NK细胞细胞毒性筛选中药物反应情况的概述。
在原发性CML CD34细胞与NK细胞共培养实验中，加入birinapant后，多数测试的效应细胞与靶细胞(E:T)比例下，CML细胞的活力显著降低(P<.05，图3B) 。而免疫调节剂地塞米松是NK细胞毒性的最强抑制剂(图2B)，达沙替尼等酪氨酸激酶抑制剂也表现出抑制作用。在单独的药物筛选实验中，地塞米松对NK细胞活力有显著杀伤作用，而达沙替尼和索曲司他对NK细胞活力影响较小，表明它们是通过损害NK细胞的细胞毒性而非直接杀死NK细胞来发挥抑制作用(图2C)。
药物对NK细胞毒性的影响与供体无关
为评估增强和抑制药物对不同供体来源NK细胞的作用是否一致，研究人员用3种不同供体的NK细胞进行实验(图2E、F)。使用包含birinapant、NVP-LCL161等多种药物的定制药板，设置9种浓度进行筛选。结果显示，尽管存在一些差异，但整体结果与初始筛选相符，不同供体来源的NK细胞对药物的反应相似。这表明药物对NK细胞毒性的影响并不因NK细胞供体的不同而改变，实验结果具有普遍性。
图2 K562慢性髓性白血病(CML)细胞和原发性CML样本中NK细胞细胞毒性的增强剂和抑制剂注：A. 按dDSS排序的前15种最有效增强NK细胞细胞毒性的药物。B. 按dDSS排序的前15种最有效抑制NK细胞细胞毒性的药物。C. 前15种最有效抑制NK细胞活力的药物。D. 药物库中包含的3种SMAC模拟物对NK细胞活力影响的剂量反应曲线。E. 来自验证药物筛选的3名健康NK细胞供体药物反应变异性的热图。F. 在3种不同NK细胞供体中验证的顶级药物的剂量反应曲线。
AC模拟物联合NK治疗降低CML细胞集落形成潜力
研究人员进一步探究SMAC模拟物对健康和CML CD34细胞集落形成能力的影响(图3E)。将NK细胞和CD34细胞按2:1的E:T比例，在有或无birinapant的情况下培养24小时，之后将细胞悬浮于MethoCult培养基中，14天后计数集落数量。结果显示，在健康样本中，birinapant处理与否对总集落数无显著影响;在CML样本中，单独使用birinapant也不影响集落数，但与NK细胞共同培养时，birinapant处理可使CML样本中的集落数降低多达57%(中位数为53.9%，范围29.4%-56.9%)。这表明birinapant联合NK细胞治疗对CML的干细胞部分具有抑制作用。
AC模拟物增强患者来源NK细胞的细胞毒性
实验对接受伊马替尼治疗的慢性期CML患者的原发性、未扩增NK细胞进行研究(图3F)。将这些NK细胞与K562-luc细胞共培养，结果发现，birinapant和NVP-LCL161在所有测试的E:T比例下，都能有效增强患者来源NK细胞的细胞毒性。同样，它们也能提高健康供体未扩增NK细胞的杀伤效力。这说明SMAC模拟物对不同来源的NK细胞均有增强细胞毒性的作用，在免疫治疗中具有潜在应用价值。
图3 Birinapant对原发性CML患者样本中NK细胞的影响注：A. 5例慢性期(CP)和6例急性期(BP)患者样本中，不同E:T比例下NK细胞细胞毒性的线图。B. 体外不同E:T比例下，原发性CML CD34+细胞对NK细胞敏感性的药物敏感性分析箱线图。C. 2例患者在不同E:T比例下CD34+细胞活力的线图，左侧患者对单独的Birinapant治疗高度敏感，右侧患者对单独的Birinapant治疗耐药。0表示对照，无NK细胞。D. 2名健康供体骨髓CD34+细胞在不同E:T比例下对NK细胞敏感性的药物敏感性分析箱线图。E. 对2例健康样本和3例CML样本进行集落形成试验的标准化总集落数柱状图。F. 药物治疗对3例接受伊马替尼治疗的CML患者(右图)、3名健康供体的健康对照NK细胞(中图)在E:T比例为2:1时未扩增NK细胞疗效的箱线图，以及仅暴露于药物而非NK细胞的对照K562-luc细胞。
单细胞RNA测序揭示药物诱导的NK细胞状态变化
通过单细胞RNA测序，研究人员定义了5种不同的NK细胞状态：静止(cluster 0)、适应性(cluster 1)、激活(cluster 2)、地塞米松特异性(cluster 3)和增殖(cluster 4)状态(图4B)。当NK细胞与K562靶细胞共培养时，会出现强烈的激活反应，>70%的NK细胞进入激活状态(cluster 2，图4C、D)。地塞米松会诱导NK细胞进入地塞米松特异性状态，即使在共培养时也会阻止NK细胞进入激活状态。达沙替尼则表现出比地塞米松更高水平的对激活标记物的抑制作用，这解释了这些药物抑制NK细胞毒性的潜在机制。
图4. 通过单细胞RNA测序鉴定有无药物处理的NK细胞表型注：A. 单细胞测序实验示意图。B. 所有条件下原代扩增NK细胞的均匀流形近似与投影(UMAP)。C. 选定药物条件下扩增NK细胞的UMAP。浅红色(TRUE)点表示来自相应条件的NK细胞，灰色(FALSE)点表示来自所有其他条件的NK细胞。D. 按实验/药物条件显示NK细胞在每个簇中百分比的柱状图。
AC模拟物诱导肿瘤暴露的NK细胞中TRAIL表达和NF-κB信号传导
在K562与NK细胞共培养的实验中，通过差异基因表达分析发现(图5A - C)，birinapant虽未改变一些NK细胞激活标记基因的表达，但诱导了死亡受体配体TNFSF10(TRAIL)和主要组织相容性复合体(MHC)II类分子HLA-DRA的表达。同时，NF-κB靶基因BIRC3和与HLA II相关的CD74也被诱导表达，暗示birinapant激活了NF-κB信号通路。TRAIL的上调可能通过增加死亡受体介导的细胞凋亡来增强NK细胞的细胞毒性。
图5 药物与靶细胞共培养引起的扩增NK细胞转录变化注：A. NK细胞暴露于K562和药物后上调和下调的选定基因点图。B-E. 选定的NK-靶细胞共培养和药物条件下差异表达基因的火山图。 F. NK共培养条件下IFNG表达的小提琴图。
抑制性药物损害NK细胞中IFNG的诱导
达沙替尼、地塞米松和索曲司他等抑制性药物会下调共培养NK细胞中的激活标记物，如CRTAM、TNFRSF9等(图5A、D、E)。同时，这些药物均下调了IFNG的表达，意味着减少了干扰素γ(IFN-γ)的产生(图5F)。这表明这些药物通过降低NK细胞的激活水平来发挥其细胞毒性抑制作用，IFNG表达的调节可能是药物影响NK细胞毒性的重要机制之一。
K细胞与不同药物共培养对K562细胞表型的影响
对K562细胞进行无监督聚类分析，发现了4个细胞簇(图6A、C)。Cluster 1是TKI特异性簇，富集于达沙替尼和伊马替尼处理的细胞。多数未接受TKI处理且未与NK细胞共培养的K562细胞属于静止簇(cluster 0和2)。与NK细胞共培养后，K562细胞大多进入NK诱导簇(cluster 3)。然而，达沙替尼处理的K562细胞与NK细胞共培养时，未表现出NK诱导反应，仍处于TKI簇;地塞米松处理的细胞虽能进入NK诱导簇，但NK细胞功能未被激活;索曲司他处理的细胞主要分布在 NK 诱导簇和静止簇。这些结果揭示了不同药物对NK细胞与K562细胞相互作用的影响存在差异。
图6 通过单细胞RNA测序鉴定有无药物处理的K562 CML细胞表型注：A. 所有条件下K562细胞的UMAP。框内基因表示每个簇的标记基因。B. 选定药物条件下K562细胞的UMAP。C. 按实验/药物条件显示K562细胞在每个簇中百分比的柱状图。
AC模拟物在K562细胞中诱导NF-κB靶基因表达
在K562细胞与NK细胞共培养时，暴露于NK细胞会诱导免疫蛋白酶体相关基因、IFN-γ通路基因、MHC-I基因和死亡受体配体TNFSF10等基因的表达(图7A、B)。加入birinapant后，K562细胞中NF-κB靶基因BIRC3、TNFSF10和CD74的表达增加(图7A、C)。虽然单个IFN-γ基因并非最显著上调的基因，但IFNG通路和TNFA-NFKB信号通路均被birinapant上调(图7D)。这表明SMAC模拟物可能通过上调这些通路来增强NK细胞的细胞毒性。
图7 药物与NK细胞共培养引起的K562靶细胞转录变化注：A. K562细胞暴露于NK细胞和药物后上调和下调的选定基因点图。B-C. 选定的NK-靶细胞共培养和药物条件下差异表达基因的火山图。D. Birinapant-K562-NK条件与K562-NK-DMSO对照条件下K562细胞中上调和下调的HALLMARK通路。(E-F) 选定的NK-靶细胞共培养和药物条件下差异表达基因的火山图。(G) Dasatinib-K562-NK条件(左)和Imatinib-K562-NK 条件(右)下K562细胞中上调和下调的HALLMARK通路。
抑制性药物对靶K562细胞的影响
与对照相比，地塞米松、索曲司他和达沙替尼显著下调了K562细胞中IFNG通路基因(如IRF1)、MHCI类分子(如HLA-E)、蛋白酶体相关基因(如PSME1、2)以及STAT1的表达(图7A、E、F)。而伊马替尼对这些基因的影响较小，与其对NK细胞毒性影响有限的结果一致。这进一步证实了抑制性药物通过干扰IFN-γ反应来抑制NK细胞对K562细胞的杀伤作用。
总结
本文通过高通量药物筛选、多种细胞实验以及单细胞RNA测序等方法，系统地研究了药物对NK细胞杀伤CML细胞毒性的影响。研究发现，SMAC模拟物能显著增强NK细胞的细胞毒性，在细胞系、患者样本和不同NK细胞供体中均有一致表现，其作用机制可能与诱导NK细胞的免疫炎症表型、上调TRAIL表达和NF-κB信号传导有关。同时，也明确了地塞米松、达沙替尼等药物会抑制NK细胞的细胞毒性，它们通过损害NK细胞的激活、下调IFNG表达等途径发挥作用。
本研究的独特价值在于，首次通过大规模的高通量筛选，全面系统地评估了多种药物对NK细胞功能的影响，减少了以往研究中单个药物测试的选择偏倚。研究结果为CML的治疗提供了新的潜在药物组合策略，即联合SMAC模拟物和NK细胞疗法，有望在生理相关和临床可实现的NK细胞剂量下发挥作用，尤其为晚期CML患者带来了新的治疗希望。此外，研究还强调了进一步研究的方向，如评估SMAC模拟物在临床前体内模型中的效果、确定最适合使用SMAC模拟物的患者群体等，为后续的研究和临床实践指明了方向。
参考文献
ygren P, Bouhlal J, Jokinen E, et al. High-throughput drug screening identifies SMAC mimetics as enhancers of NK cell cytotoxicity in chronic myeloid leukemia[J]. Blood, 2025.
导语：慢性髓性白血病(CML)作为一种髓增殖性肿瘤，费城染色体导致的BCR::ABL1融合基因是其关键致病因素。酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的问世，显著改善了慢性期CML患者的预后，如今治疗目标已转变为TKI停药和无治疗缓解。然而，在尝试TKI停药的患者中，仅有38%-64%能够维持无治疗缓解，这是因为体内残留的白血病干细胞(LSCs)对TKI治疗具有耐受性，成为疾病进展和复发的隐患。
慢性髓性白血病治疗遇瓶颈?NK细胞疗法或成新希望
在CML治疗的艰难征程中，自然杀伤(NK)细胞免疫疗法崭露头角，为患者带来了新的希望。NK细胞作为先天免疫细胞，能够识别并杀伤病毒感染细胞和恶性细胞。多项研究表明，NK细胞在CML患者的治疗中意义重大，较高比例的成熟NK细胞与TKI停药的成功密切相关 。不过，TKIs与NK细胞功能之间存在复杂的相互作用，其对NK细胞既有增强作用，也有抑制作用，这无疑增加了治疗的复杂性。
此外，小分子药物在增强NK细胞毒性方面具有潜在价值，但此前相关研究较少。2025年4月，Blood杂志发表了一篇题为“High-throughput drug screening identifies SMAC mimetics as enhancers of NK-cell cytotoxicity in chronic myeloid leukemia”的文章，该研究旨在探索影响NK细胞对CML细胞毒性的药物类别，为未来免疫治疗奠定基础，这在CML治疗领域具有重要的开创性意义。
如何筛选增效药物?高通量筛选联合多实验探究
本研究是一项多方法联合的实验研究，旨在通过高通量药物筛选，识别能够影响NK细胞对CML细胞毒性的药物，并深入探究其作用机制。
在样本纳入筛选方面，研究使用了K562-luc细胞系以及来自健康供体的NK细胞。同时，还纳入了慢性期(CP)和急性期(BP)的CML患者的样本，以及健康供体的骨髓CD34细胞作为对照，确保样本的多样性和代表性。
实验分组上，设置了多种不同的组合。在NK细胞共培养药物敏感性筛选实验中，将K562-luc细胞与NK细胞共培养，并暴露于包含527种研究和已批准的肿瘤药物的文库中;在验证筛选实验中，使用定制药物板对选定药物进行重复实验;在NK细胞单独筛选实验中，则不添加靶细胞，单独检测药物对NK细胞活力的影响。此外，还有基于流式细胞术的原发性CML细胞毒性实验、集落形成实验以及患者NK细胞实验等，每个实验都根据研究目的进行了细致的分组。
干预措施主要是让细胞暴露于不同的药物中，观察细胞的反应。主要评价指标包括药物敏感性评分(DSSs)、细胞活力、细胞毒性、集落形成能力等;次要评价指标则通过单细胞RNA测序来分析药物诱导的转录组变化，以深入了解药物的作用机制。通过这些精心设计的实验分组和评价指标，全面系统地探究药物对NK细胞功能的影响。
SMAC模拟物能否增效?实验数据给出肯定答案
AC模拟物增强NK细胞毒性，部分药物起抑制作用
在高通量药物筛选实验中，研究人员对527种药物进行测试(图1C、D)。以差异药物敏感性评分(dDSS)为指标，设定dDSS>7.5为增强作用，dDSS<-7.5为抑制作用。结果显示，36种药物对NK细胞毒性有抑制作用，4种药物有增强作用 。其中，SMAC模拟物NVP-LCL161和birinapant是NK细胞毒性的强效增强剂(图2A)，在细胞系和原发性患者样本实验中均得到验证。
图1. 高通量药物筛选鉴定调节NK细胞细胞毒性的药物注：A. 高通量共培养药物敏感性和耐药性测试(DSRT)示意图。B. K562-luc细胞在与NK细胞以不同效应细胞与靶细胞(E:T)比例共培养4小时或24小时后的活力，其中柱状图表示标准差，点表示每种条件下的6个技术重复。C. 化合物库中主要药物类别的概述。D. 24小时NK细胞细胞毒性筛选中药物反应情况的概述。
在原发性CML CD34细胞与NK细胞共培养实验中，加入birinapant后，多数测试的效应细胞与靶细胞(E:T)比例下，CML细胞的活力显著降低(P<.05，图3B) 。而免疫调节剂地塞米松是NK细胞毒性的最强抑制剂(图2B)，达沙替尼等酪氨酸激酶抑制剂也表现出抑制作用。在单独的药物筛选实验中，地塞米松对NK细胞活力有显著杀伤作用，而达沙替尼和索曲司他对NK细胞活力影响较小，表明它们是通过损害NK细胞的细胞毒性而非直接杀死NK细胞来发挥抑制作用(图2C)。
药物对NK细胞毒性的影响与供体无关
为评估增强和抑制药物对不同供体来源NK细胞的作用是否一致，研究人员用3种不同供体的NK细胞进行实验(图2E、F)。使用包含birinapant、NVP-LCL161等多种药物的定制药板，设置9种浓度进行筛选。结果显示，尽管存在一些差异，但整体结果与初始筛选相符，不同供体来源的NK细胞对药物的反应相似。这表明药物对NK细胞毒性的影响并不因NK细胞供体的不同而改变，实验结果具有普遍性。
图2 K562慢性髓性白血病(CML)细胞和原发性CML样本中NK细胞细胞毒性的增强剂和抑制剂注：A. 按dDSS排序的前15种最有效增强NK细胞细胞毒性的药物。B. 按dDSS排序的前15种最有效抑制NK细胞细胞毒性的药物。C. 前15种最有效抑制NK细胞活力的药物。D. 药物库中包含的3种SMAC模拟物对NK细胞活力影响的剂量反应曲线。E. 来自验证药物筛选的3名健康NK细胞供体药物反应变异性的热图。F. 在3种不同NK细胞供体中验证的顶级药物的剂量反应曲线。
AC模拟物联合NK治疗降低CML细胞集落形成潜力
研究人员进一步探究SMAC模拟物对健康和CML CD34细胞集落形成能力的影响(图3E)。将NK细胞和CD34细胞按2:1的E:T比例，在有或无birinapant的情况下培养24小时，之后将细胞悬浮于MethoCult培养基中，14天后计数集落数量。结果显示，在健康样本中，birinapant处理与否对总集落数无显著影响;在CML样本中，单独使用birinapant也不影响集落数，但与NK细胞共同培养时，birinapant处理可使CML样本中的集落数降低多达57%(中位数为53.9%，范围29.4%-56.9%)。这表明birinapant联合NK细胞治疗对CML的干细胞部分具有抑制作用。
AC模拟物增强患者来源NK细胞的细胞毒性
实验对接受伊马替尼治疗的慢性期CML患者的原发性、未扩增NK细胞进行研究(图3F)。将这些NK细胞与K562-luc细胞共培养，结果发现，birinapant和NVP-LCL161在所有测试的E:T比例下，都能有效增强患者来源NK细胞的细胞毒性。同样，它们也能提高健康供体未扩增NK细胞的杀伤效力。这说明SMAC模拟物对不同来源的NK细胞均有增强细胞毒性的作用，在免疫治疗中具有潜在应用价值。
图3 Birinapant对原发性CML患者样本中NK细胞的影响注：A. 5例慢性期(CP)和6例急性期(BP)患者样本中，不同E:T比例下NK细胞细胞毒性的线图。B. 体外不同E:T比例下，原发性CML CD34+细胞对NK细胞敏感性的药物敏感性分析箱线图。C. 2例患者在不同E:T比例下CD34+细胞活力的线图，左侧患者对单独的Birinapant治疗高度敏感，右侧患者对单独的Birinapant治疗耐药。0表示对照，无NK细胞。D. 2名健康供体骨髓CD34+细胞在不同E:T比例下对NK细胞敏感性的药物敏感性分析箱线图。E. 对2例健康样本和3例CML样本进行集落形成试验的标准化总集落数柱状图。F. 药物治疗对3例接受伊马替尼治疗的CML患者(右图)、3名健康供体的健康对照NK细胞(中图)在E:T比例为2:1时未扩增NK细胞疗效的箱线图，以及仅暴露于药物而非NK细胞的对照K562-luc细胞。
单细胞RNA测序揭示药物诱导的NK细胞状态变化
通过单细胞RNA测序，研究人员定义了5种不同的NK细胞状态：静止(cluster 0)、适应性(cluster 1)、激活(cluster 2)、地塞米松特异性(cluster 3)和增殖(cluster 4)状态(图4B)。当NK细胞与K562靶细胞共培养时，会出现强烈的激活反应，>70%的NK细胞进入激活状态(cluster 2，图4C、D)。地塞米松会诱导NK细胞进入地塞米松特异性状态，即使在共培养时也会阻止NK细胞进入激活状态。达沙替尼则表现出比地塞米松更高水平的对激活标记物的抑制作用，这解释了这些药物抑制NK细胞毒性的潜在机制。
图4. 通过单细胞RNA测序鉴定有无药物处理的NK细胞表型注：A. 单细胞测序实验示意图。B. 所有条件下原代扩增NK细胞的均匀流形近似与投影(UMAP)。C. 选定药物条件下扩增NK细胞的UMAP。浅红色(TRUE)点表示来自相应条件的NK细胞，灰色(FALSE)点表示来自所有其他条件的NK细胞。D. 按实验/药物条件显示NK细胞在每个簇中百分比的柱状图。
AC模拟物诱导肿瘤暴露的NK细胞中TRAIL表达和NF-κB信号传导
在K562与NK细胞共培养的实验中，通过差异基因表达分析发现(图5A - C)，birinapant虽未改变一些NK细胞激活标记基因的表达，但诱导了死亡受体配体TNFSF10(TRAIL)和主要组织相容性复合体(MHC)II类分子HLA-DRA的表达。同时，NF-κB靶基因BIRC3和与HLA II相关的CD74也被诱导表达，暗示birinapant激活了NF-κB信号通路。TRAIL的上调可能通过增加死亡受体介导的细胞凋亡来增强NK细胞的细胞毒性。
图5 药物与靶细胞共培养引起的扩增NK细胞转录变化注：A. NK细胞暴露于K562和药物后上调和下调的选定基因点图。B-E. 选定的NK-靶细胞共培养和药物条件下差异表达基因的火山图。 F. NK共培养条件下IFNG表达的小提琴图。
抑制性药物损害NK细胞中IFNG的诱导
达沙替尼、地塞米松和索曲司他等抑制性药物会下调共培养NK细胞中的激活标记物，如CRTAM、TNFRSF9等(图5A、D、E)。同时，这些药物均下调了IFNG的表达，意味着减少了干扰素γ(IFN-γ)的产生(图5F)。这表明这些药物通过降低NK细胞的激活水平来发挥其细胞毒性抑制作用，IFNG表达的调节可能是药物影响NK细胞毒性的重要机制之一。
K细胞与不同药物共培养对K562细胞表型的影响
对K562细胞进行无监督聚类分析，发现了4个细胞簇(图6A、C)。Cluster 1是TKI特异性簇，富集于达沙替尼和伊马替尼处理的细胞。多数未接受TKI处理且未与NK细胞共培养的K562细胞属于静止簇(cluster 0和2)。与NK细胞共培养后，K562细胞大多进入NK诱导簇(cluster 3)。然而，达沙替尼处理的K562细胞与NK细胞共培养时，未表现出NK诱导反应，仍处于TKI簇;地塞米松处理的细胞虽能进入NK诱导簇，但NK细胞功能未被激活;索曲司他处理的细胞主要分布在 NK 诱导簇和静止簇。这些结果揭示了不同药物对NK细胞与K562细胞相互作用的影响存在差异。
图6 通过单细胞RNA测序鉴定有无药物处理的K562 CML细胞表型注：A. 所有条件下K562细胞的UMAP。框内基因表示每个簇的标记基因。B. 选定药物条件下K562细胞的UMAP。C. 按实验/药物条件显示K562细胞在每个簇中百分比的柱状图。
AC模拟物在K562细胞中诱导NF-κB靶基因表达
在K562细胞与NK细胞共培养时，暴露于NK细胞会诱导免疫蛋白酶体相关基因、IFN-γ通路基因、MHC-I基因和死亡受体配体TNFSF10等基因的表达(图7A、B)。加入birinapant后，K562细胞中NF-κB靶基因BIRC3、TNFSF10和CD74的表达增加(图7A、C)。虽然单个IFN-γ基因并非最显著上调的基因，但IFNG通路和TNFA-NFKB信号通路均被birinapant上调(图7D)。这表明SMAC模拟物可能通过上调这些通路来增强NK细胞的细胞毒性。
图7 药物与NK细胞共培养引起的K562靶细胞转录变化注：A. K562细胞暴露于NK细胞和药物后上调和下调的选定基因点图。B-C. 选定的NK-靶细胞共培养和药物条件下差异表达基因的火山图。D. Birinapant-K562-NK条件与K562-NK-DMSO对照条件下K562细胞中上调和下调的HALLMARK通路。(E-F) 选定的NK-靶细胞共培养和药物条件下差异表达基因的火山图。(G) Dasatinib-K562-NK条件(左)和Imatinib-K562-NK 条件(右)下K562细胞中上调和下调的HALLMARK通路。
抑制性药物对靶K562细胞的影响
与对照相比，地塞米松、索曲司他和达沙替尼显著下调了K562细胞中IFNG通路基因(如IRF1)、MHCI类分子(如HLA-E)、蛋白酶体相关基因(如PSME1、2)以及STAT1的表达(图7A、E、F)。而伊马替尼对这些基因的影响较小，与其对NK细胞毒性影响有限的结果一致。这进一步证实了抑制性药物通过干扰IFN-γ反应来抑制NK细胞对K562细胞的杀伤作用。
总结
本文通过高通量药物筛选、多种细胞实验以及单细胞RNA测序等方法，系统地研究了药物对NK细胞杀伤CML细胞毒性的影响。研究发现，SMAC模拟物能显著增强NK细胞的细胞毒性，在细胞系、患者样本和不同NK细胞供体中均有一致表现，其作用机制可能与诱导NK细胞的免疫炎症表型、上调TRAIL表达和NF-κB信号传导有关。同时，也明确了地塞米松、达沙替尼等药物会抑制NK细胞的细胞毒性，它们通过损害NK细胞的激活、下调IFNG表达等途径发挥作用。
本研究的独特价值在于，首次通过大规模的高通量筛选，全面系统地评估了多种药物对NK细胞功能的影响，减少了以往研究中单个药物测试的选择偏倚。研究结果为CML的治疗提供了新的潜在药物组合策略，即联合SMAC模拟物和NK细胞疗法，有望在生理相关和临床可实现的NK细胞剂量下发挥作用，尤其为晚期CML患者带来了新的治疗希望。此外，研究还强调了进一步研究的方向，如评估SMAC模拟物在临床前体内模型中的效果、确定最适合使用SMAC模拟物的患者群体等，为后续的研究和临床实践指明了方向。
参考文献
ygren P, Bouhlal J, Jokinen E, et al. High-throughput drug screening identifies SMAC mimetics as enhancers of NK cell cytotoxicity in chronic myeloid leukemia[J]. Blood, 2025.
