导语：多发性骨髓瘤(MM)是一种恶性浆细胞病，尽管蛋白酶体抑制剂(PIs)等药物显著改善了患者生存，复发/难治性患者仍面临治疗挑战。溶瘤病毒(如呼肠孤病毒RV)因选择性感染肿瘤细胞的特性成为潜在疗法，但早期临床发现单药RV虽能到达骨髓却无法有效复制和控制疾病，提示需联合其他手段突破免疫限制。
2025年1月,Journal of Hematology Oncology发表的“Proteasome inhibition enhances oncolytic reovirus therapy in multiple myeloma independently of its direct cytotoxic effects”研究，聚焦PIs与RV的协同作用，首次揭示PIs可通过调节单核细胞相关免疫通路增强RV疗效。此前研究已知PIs与RV联用能提升抗肿瘤活性，但分子机制尤其是免疫细胞的作用尚不明确，PI是否依赖直接细胞毒性发挥作用也未阐明，本研究旨在填补这一空白。
基础与临床结合探究增效路径，多技术解析PI联合RV的双重作用
本研究是一项转化医学研究，通过基础实验与临床数据结合，阐明PIs增强RV溶瘤疗效的机制并验证安全性和有效性。基础实验采用电子显微镜、单细胞质谱流式(CyTOF)、流式细胞术等技术，分析RV在骨髓瘤细胞和免疫细胞中的感染情况，探讨NF-κB通路激活与PI干预的关系。研究构建共培养模型和单核细胞耗竭小鼠模型，验证单核细胞在病毒递送中的作用，并利用T细胞受体(TCR)测序分析免疫应答变化。临床部分开展针对13例PI耐药MM患者的1b期临床试验(NCT02101944)，采用3+3剂量递增设计，评估RV(Pelareorep)联合卡非佐米(CFZ)的最大耐受剂量、安全性及疗效。主要终点包括病毒复制证据和临床应答率，次要终点涉及免疫微环境变化如单核细胞和T细胞亚群动态。
单核细胞助力病毒递送，PI双重调控逆转治疗困局
蛋白酶体抑制剂不直接增强骨髓瘤细胞感染，依赖肿瘤微环境发挥作用
作者首先通过体外实验证实，蛋白酶体抑制剂(PI)如卡非佐米(CFZ)单独或联合呼肠孤病毒(RV)处理骨髓瘤细胞系(如RPMI-8226、MM.1S)时，RV基因组表达、衣壳蛋白(σ-NS)水平及凋亡率均未显著提升，部分细胞系甚至出现病毒复制减少(图1A-D)。电子显微镜进一步显示，PI处理后骨髓瘤细胞内RV衣壳单位计数显著下降(MM.1S细胞24小时p=0.0006，RPMI-8226细胞48小时p<0.0001，图1E-F)。这提示PI的增效作用并非通过直接促进病毒在肿瘤细胞内的复制，而是依赖肿瘤微环境中的免疫细胞。
图 1 PIs 需通过微环境参与才能增强 RV 诱导的 MM 细胞杀伤作用(A)q-RT-PCR 检测 MM 细胞系(RPMI-8226、U266、MM.1S、L363、H929)经 CFZ(5 nM)和 / 或 Pelareorep(5 MOI)处理24 小时后的 RV 基因组(mRNA)表达。(B-C) 偏移直方图显示对Pelareorep 感染高敏感(RPMI-8226、U266)和中等敏感(MM.1S、H929、L363)的细胞系经 CFZ(5 nM)或Pelareorep(5 MOI)单药或联合处理 24 和 48 小时后的 σ- 非结构衣壳蛋白(σ-NS)表达。(D) 代表性流式细胞术图(Annexin V-FITC/PI 染色检测凋亡)显示 MM.1S 细胞经CFZ(2.5 nM)和 RV(5 MOI)单药或联合处理 24-48 小时后的凋亡率(%)。(E-F) 透射电子显微镜(TEM)及定量分析 MM.1S(E)和 RPMI-8226(F)细胞经 CFZ(5 nM)或 Pelareorep(5 MOI)单药或联合处理 24 和 48 小时后的衣壳形成。(G) 柱状图显示 CD138⁺部分(MM细胞)经 CFZ + RV 联合处理 48 小时后存活率(%)显著低于单药组，采用单因素方差分析(**p≤0.01，n=4 例 MM 患者)。(H) 柱状图显示在相同实验条件下，匹配的 CD138⁻部分的细胞活力(%)无显著下降。(I) 健康供体(HD)PBMCs 感染 RV(10 MOI)后 RV 衣壳 mRNA 水平表达(与对照组相比的倍数变化)。(J) 使用 34 抗体 CyTOF panel 生成 FCS 文件，通过 Cytobank© 平台进行层次聚类和统计映射。(K) 柱状图显示(J)中处理条件下的 RV 衣壳信号强度(%)。(L) 复发 / 难治性 MM(RRMM)患者的 PBMCs 经 RV(5 MOI)和 CFZ(2.5 nM)处理并与 MM.1S 细胞共培养 12 小时后，病毒基因组表达的 q-RT-PCR 检测。数据以均值 ±SEM 表示(三次重复)。(M-N) 流式细胞术杀伤实验：使用 RRMM 患者的单核细胞(BM=3 例，PB=2 例)与 GFP⁺ MM.1S 细胞按8:1 比例共培养 24 小时，经 RV(5 MOI)和 CFZ(2.5 nM)单药或联合处理。(O) 柱状图显示RPMI-8226-BTZ 耐药细胞与 HD PBMCs 共培养并经 RV(5 MOI)和 CFZ(5 nM)单药或联合处理后的凋亡诱导情况(与对照相比的倍数变化，独立三次重复)。
当使用包含免疫细胞的骨髓单个核细胞(BM-MNCs)进行共培养时，CFZ+RV联合处理显著降低CD138⁺骨髓瘤细胞的存活率(联合组vsRV单药p=0.01，vsCFZ单药p=0.008，图1G)，而CD138⁻非肿瘤细胞无明显变化(图1H)。这表明PI需通过微环境中的免疫成分间接发挥作用。
单核细胞是RV体内复制与递送的核心载体，PI通过抑制NF-κB解除其抗病毒限制
单细胞质谱流式(CyTOF)分析显示，RV衣壳蛋白(σ-NS)主要表达于经典单核细胞(CD45⁺CD14⁺HLA-DR⁺)，在健康供体和MM患者的外周血单核细胞(PBMCs)中，CD14⁺细胞的σ-NS信号强度显著高于CD14⁻细胞(MM患者p=0.034，健康供体p=0.03，图2A-C)。PI处理后，经典单核细胞内RV基因组复制和衣壳蛋白表达显著增加(CFZ预处理组衣壳计数4605vsRV单药组2890，图2D-E)，而CD14⁻的T细胞、B细胞、NK细胞中未见病毒复制增强(图3I)。
图 2 蛋白酶体抑制剂增强病毒复制依赖单核细胞(A)小提琴图显示 CyTOF 分析 3 例 MM 患者的 σ-NS 信号(*p≤0.05)。(B-C) 使用 34 抗体 CyTOF panel 生成 FCS 文件，通过 Cytobank© 平台进行层次聚类和统计映射。(D-E) MM 患者PBMCs 经 RV(10 MOI)单药或联合 CFZ(2.5 nM)处理后的CyTOF 高保真 FlowSOM 及 t-SNE 热图，显示 RV + CFZ 共处理或预处理后经典单核细胞中 RV 衣壳(σ-NS)检测增加(计数：RV=2890，RV+CFZ 预处理 = 4605，RV+CFZ共处理 = 4702)(D)，不同单核细胞亚群中 RV 绝对计数检测的热图图形表示(E)。(F) RV 感染的HD-PBMCs 或分离的 HD-CD14⁺细胞 24小时后病毒基因组表达的 q-RT-PCR 检测，标准化至对照GAPDH，以均值 ±SEM 表示(三次重复，与 RV 单药相比的倍数变化)。(G) Western blot 分析 HD CD14⁺分选细胞经 PIs(CFZ 和 BTZ，2.5 nM)和 RV 处理 8 小时后的 σ-NS 病毒蛋白表达。(H) 偏移直方图显示流式细胞术检测不同免疫亚群的 JAM-1 表达(实验重复三次独立重复)。(I) CD14⁺细胞与 JAM-1 阻断抗体(10-50-100-150 μg/mL)孵育 1 小时后感染 RV 5 MOI 24 小时，病毒基因组表达的 q-RT-PCR 检测标准化至对照 GAPDH，以均值 ±SEM 表示(三次重复，与 RV 单药相比，****p≤0.0001)。(J) THP-1 细胞经特异性JAM-1 敲低后 Western blot 检测 RV(σNS)蛋白表达。(K) 小鼠实验示意图：(L-M) 小提琴图显示流式细胞术分析处理后小鼠骨髓 RV(σ-NS)衣壳形成(**p≤0.01)(L)及 MM-CD138⁺细胞中的衣壳形成(*p<0.01 和 p≤0.05)(M)。
机制研究发现，RV感染单核细胞后诱导NF-κB通路激活(p65核转位增加，p<0.0001)，而PI可显著抑制这一过程(CFZ处理后p65核转位减少，p<0.0001，图3A-C)。NF-κB抑制导致Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)释放减少(RV+CFZ组IFN-β水平较RV单药组降低60%，p<0.0001，图3K-L)，从而解除单核细胞的抗病毒状态，促进病毒复制。阻断单核细胞表面受体JAM-1后，RV复制显著受损(p<0.0001，图2I-J)，证实单核细胞通过JAM-1介导病毒摄取。
图 3 CFZ 抑制单核细胞介导的抗病毒反应但不影响 T 细胞活化(A)代表性免疫荧光图合并显示 HD 和 RRMM CD14⁺分离细胞经CFZ 处理 30 分钟后感染或未感染 RV(5 MOI)2-4 小时的 p65 染色(绿色)和 DAPI 核酸染色(蓝色)。(B-C) 基于图像的荧光染色强度与像素位置的定量分析，HD 细胞 2 小时(B)和 RRMM CD14⁺细胞 4 小时(C)的 50 个代表性细胞。(D-E) 直方图显示 RV 感染(5 MOI)或未感染的 HD-PBMCs 经不同浓度(1 或 2.5 nM)Bay-11 处理 24小时后的 IFN-α(D)和 IFN-β(E)mRNA 表达，标准化至对照 GAPDH，数据以均值 ±SD 表示(与对照相比的倍数变化)。(F) 流式细胞术杀伤实验：HD PBMCs 与 GFP⁺ MM.1S 细胞按8:1 比例共培养 24 小时，经 RV(5 MOI)和 Bay-11(2.5 nM)单药或联合处理(实验重复三次独立重复)。(G) 柱状图显示杀伤率(7-AAD 阳性 %)，以均值 ±SEM表示。(H) q-RT-PCR 检测(F)相同实验条件下的 RV 衣壳形成，数据标准化并以均值 ±SD 表示(与对照 GAPDH 相比的倍数变化)。(I) THP-1 细胞经Bay-11、BTZ、CFZ(2.5 nM)和 RV(5 MOI)单药或联合处理后的 Western blot 检测 σ-NS 蛋白表达。(J) HEK293 细胞转染NF-κB 荧光素酶报告基因质粒，经 RV(5MOI)和 CFZ(10 nM 和 2.5 nM)处理至 72 小时的荧光素酶报告实验。(K-L) q-RT-PCR 检测 HD PBMCs 经 RV(5 MOI)和 CFZ(2.5 nM)处理不同时间点(2-4-12-24 小时)的 Ⅰ 型干扰素(IFN-α 和IFN-β)诱导情况，数据标准化至对照 GAPDH，以均值±SD 表示(与对照相比的倍数变化)。(M) 多重细胞因子谱热图：HD PBMCs 经 CFZ、RV 或联合处理 4 小时的上清液分析，显示 22 种细胞因子中的 14 种可检测信号。(N-O-P) 质谱流式 t-SNE 热图显示 RRMM 患者新鲜分离 PBMCs 经 RV 感染(10 MOI)和 CFZ 处理(2.5 nM)24 小时后的 CD69 和 CD80 表达。(Q-R) 实时成像显示从 1 例患者分离的 CD14⁺细胞吞噬活性的三个代表性视野，CFZ 处理的巨噬细胞较对照巨噬细胞吞噬能力显著增强(右图示平均荧光强度(MFI)差异)(R)。(S-T) 代表性流式细胞术分析显示 4 例健康供体之一的设门策略，点图(S)显示 RV(5 MOI)+ CFZ(2.5 nM)处理过夜后CD14⁺与 GFP⁺ MM.1S 细胞共定位增加。
在单核细胞耗竭的小鼠模型中，RV感染骨髓瘤细胞的能力显著下降(骨髓RV衣壳阳性细胞比例：对照组26.8%vs耗竭组8.5%，p=0.004，图2L-M)，进一步验证单核细胞是病毒向肿瘤细胞递送的关键载体。
I联合RV重塑免疫微环境，激活CD8⁺T细胞应答
体外实验显示，CFZ+RV处理增强单核细胞对骨髓瘤细胞的吞噬能力(CD14⁺/GFP⁺双阳性细胞比例：联合组32.5%vs对照组4%，p=0.018，图3S-T)，并促进单核细胞表达共刺激分子CD80(图3N-O)。在临床样本中，治疗后外周血经典单核细胞(CD14⁺⁺CD16⁻)计数增加2.3倍(p=0.006，图5A-C)，CD69⁺活化单核细胞比例上升(p=0.047，图5D)。
图 5 RV 联合 PI 诱导免疫激活(A)小提琴图显示纳入 RV + CFZ 1b 期临床试验的复发 MM 患者 PB 的多参数流式细胞术研究，显示总单核细胞绝对计数整体扩增(**p≤0.01)。(B) 线图显示复发 MM 患者 PB 的纵向多参数流式细胞术研究，显示总单核细胞绝对计数随时间变化。(C-D) 小提琴图显示治疗至 C1D9 时 CD14⁺⁺CD16⁻经典单核细胞频率更高(C)及总单核细胞中 CD69 活化标记物增加(p=0.047)(D)，与基线 C1D1相比。(E) 小提琴图显示 4 例治疗前未暴露于 CFZ 的患者与4 例治疗前暴露于 CFZ 的患者相比，PB 单核细胞区室中 CD69 活化标记物轻度增加。(F-G) 小提琴图显示至 C1D9 时CD8 表达增加(F)和 CD4 表达减少(G)，数据以相对于基线的变化 % 表示，Wilcoxon符号秩检验 p 值：*p≤0.05。(H) 小提琴图显示从基线至C1D9 的 CD4/CD8 比值下降，数据以相对于基线的变化% 表示，Wilcoxon 符号秩检验 p 值：*p≤0.05。(I) 使用 Maxpar 直接免疫分析系统对纳入 RV + CFZ 1b 期的 CFZ 耐药患者(RRMM-1)进行纵向深度免疫分析，采用 30 标记抗体干 panel。(J-K-L) 纳入 RV + CFZ 1b 期的 3 例纵向 CFZ 耐药患者的t-SNE 热图，显示治疗后 C1D9(RRMM-1，J)、C1D16(RRMM-2，K)、治疗 4 小时后 C1D1(RRMM-3，L)的选定单核细胞群表达。(M-N-O) 热图显示纳入RV + CFZ 1b 期的 3 例纵向 CFZ 耐药患者的不同单核细胞区室绝对计数。(P-Q-R) 热图显示治疗过程中初始和记忆调节性 T 细胞(Tregs)的总体分布。
T细胞动态方面，治疗后CD8⁺效应记忆T细胞(EMCD8⁺)比例显著增加(治疗2周后占比：联合组35%vs基线18%，p<0.0001，图6F-H)，T细胞克隆性降低(应答患者CDR3多样性指数较非应答者低28%，p=0.06)，提示抗原特异性T细胞扩增。ELISpot实验显示，RV+CFZ处理小鼠的脾细胞在接触RV感染的骨髓瘤细胞时，IFN-γ分泌量增加3倍(p=0.006，图6J-K)，证实功能性细胞免疫应答的激活。
图 6 RV 联合 CFZ 治疗促进针对 MM 细胞的 T 细胞应答(A-B-C)CD8 蛋白 IHC 检测(棕色信号，蓝色复染)显示 PR 患者治疗前(A)和治疗后(B)的变化
1b期临床试验证实联合疗法安全性与有效性，应答与病毒复制及免疫激活相关
在13例PI耐药MM患者中，RV+CFZ联合治疗的客观应答率(ORR)达70%(9/13)，包括2例非常好的部分缓解(VGPR)和4例部分缓解(PR)。剂量水平1(DL1)组ORR更高达83.3%(5/6)，且应答持续时间更长(中位治疗天数331.6天vs低剂量组54.5天)。骨髓检测显示，治疗后RV衣壳蛋白阳性细胞数显著增加(DL1组p=0.028，图4E)，伴随caspase-3激活(p=0.005，图4I)和PD-L1表达上调(p=0.005，图4F-H)，提示病毒复制诱导肿瘤细胞凋亡。
图 4 RV 联合 CFZ 增加 MM 患者骨髓中的病毒复制(A)复发 MM 患者纳入 Pelareorep 联合卡非佐米 1b 期临床试验的治疗方案示意图。(B) 瀑布图显示各患者最佳缓解情况，总缓解率(ORR)为 53.8%(7/13)，临床获益率(CBR)为 69.2%(9/13)。剂量水平 1(DL1)组 ORR 为 83.3%(5/6)，CBR 为 100%，包括非常好的部分缓解(VGPR，n=2)、部分缓解(PR，n=4)、最小缓解(MR，n=1)、稳定疾病(SD，n=3)和进展性疾病(PD，n=1)。剂量水平 - 1(DL-1)组 ORR 为 28.6%(2/7)，CBR 为 42.9%(3/7)。(C-D) 免疫组化(IHC)4 倍放大图像显示单药 RV 和 RV + CFZ 治疗患者治疗前后呼肠孤病毒 RNA(蓝色信号，粉色复染)和呼肠孤病毒衣壳蛋白(棕色信号，蓝色复染)的原位检测数据。(E) 柱状图显示低剂量和标准剂量 CFZ 治疗后骨髓中 σ-NS 蛋白检测(*p=0.028)，每个值代表 200 倍视野下的阳性细胞数。(F) PD-L1 蛋白 IHC 4 倍放大图像(棕色信号，蓝色复染)显示治疗前后变化(n=5)。(G) 免疫荧光 4 倍放大图像显示 PD-L1(红色荧光)和 CD138(绿色荧光)共表达，治疗后 20 倍放大合并图像显示共表达为黄色荧光(比例尺 150 微米)。(H-I) 柱状图显示 RV + CFZ 治疗患者 MM 细胞表面 PD-L1(H)和 Caspase-3(I)较治疗前显著上调(*p=0.005)，单药 RV 治疗患者未观察到该效应。每个值代表 200 倍视野下的阳性细胞数。
安全性方面，主要不良事件为1-2级高血压(38%)和血小板减少(23%)，仅2例出现剂量限制性毒性(血栓性血小板减少和心力衰竭)，显示联合方案耐受性良好。
总结
本研究发现蛋白酶体抑制剂通过“解除单核细胞抗病毒限制”和“激活细胞免疫”双重机制增强溶瘤病毒疗效，突破了PI仅依赖直接细胞毒性的传统认知。研究证实单核细胞是RV在体内的主要复制和递送载体，PI通过抑制NF-κB通路阻断其抗病毒反应，同时重塑免疫微环境，促进单核细胞吞噬功能和CD8⁺T细胞抗肿瘤应答，且该效应与肿瘤细胞对PI的敏感性无关。临床研究在PI耐药患者中验证了联合疗法的有效性，70%应答率显著优于单药数据，为复发/难治性MM提供了“溶瘤病毒+免疫调控”的新治疗模式。未来可探索PI与PD-L1抑制剂联用，克服病毒感染诱导的免疫检查点上调，进一步拓展该疗法在实体瘤中的应用。
参考文献
Dona A A, Tandoh T, Nigam L, et al. Proteasome inhibition enhances oncolytic reovirus therapy in multiple myeloma independently of its direct cytotoxic effects[J]. Journal of Hematology Oncology, 2025, 18(1): 1.
导语：多发性骨髓瘤(MM)是一种恶性浆细胞病，尽管蛋白酶体抑制剂(PIs)等药物显著改善了患者生存，复发/难治性患者仍面临治疗挑战。溶瘤病毒(如呼肠孤病毒RV)因选择性感染肿瘤细胞的特性成为潜在疗法，但早期临床发现单药RV虽能到达骨髓却无法有效复制和控制疾病，提示需联合其他手段突破免疫限制。
2025年1月,Journal of Hematology Oncology发表的“Proteasome inhibition enhances oncolytic reovirus therapy in multiple myeloma independently of its direct cytotoxic effects”研究，聚焦PIs与RV的协同作用，首次揭示PIs可通过调节单核细胞相关免疫通路增强RV疗效。此前研究已知PIs与RV联用能提升抗肿瘤活性，但分子机制尤其是免疫细胞的作用尚不明确，PI是否依赖直接细胞毒性发挥作用也未阐明，本研究旨在填补这一空白。
基础与临床结合探究增效路径，多技术解析PI联合RV的双重作用
本研究是一项转化医学研究，通过基础实验与临床数据结合，阐明PIs增强RV溶瘤疗效的机制并验证安全性和有效性。基础实验采用电子显微镜、单细胞质谱流式(CyTOF)、流式细胞术等技术，分析RV在骨髓瘤细胞和免疫细胞中的感染情况，探讨NF-κB通路激活与PI干预的关系。研究构建共培养模型和单核细胞耗竭小鼠模型，验证单核细胞在病毒递送中的作用，并利用T细胞受体(TCR)测序分析免疫应答变化。临床部分开展针对13例PI耐药MM患者的1b期临床试验(NCT02101944)，采用3+3剂量递增设计，评估RV(Pelareorep)联合卡非佐米(CFZ)的最大耐受剂量、安全性及疗效。主要终点包括病毒复制证据和临床应答率，次要终点涉及免疫微环境变化如单核细胞和T细胞亚群动态。
单核细胞助力病毒递送，PI双重调控逆转治疗困局
蛋白酶体抑制剂不直接增强骨髓瘤细胞感染，依赖肿瘤微环境发挥作用
作者首先通过体外实验证实，蛋白酶体抑制剂(PI)如卡非佐米(CFZ)单独或联合呼肠孤病毒(RV)处理骨髓瘤细胞系(如RPMI-8226、MM.1S)时，RV基因组表达、衣壳蛋白(σ-NS)水平及凋亡率均未显著提升，部分细胞系甚至出现病毒复制减少(图1A-D)。电子显微镜进一步显示，PI处理后骨髓瘤细胞内RV衣壳单位计数显著下降(MM.1S细胞24小时p=0.0006，RPMI-8226细胞48小时p<0.0001，图1E-F)。这提示PI的增效作用并非通过直接促进病毒在肿瘤细胞内的复制，而是依赖肿瘤微环境中的免疫细胞。
图 1 PIs 需通过微环境参与才能增强 RV 诱导的 MM 细胞杀伤作用(A)q-RT-PCR 检测 MM 细胞系(RPMI-8226、U266、MM.1S、L363、H929)经 CFZ(5 nM)和 / 或 Pelareorep(5 MOI)处理24 小时后的 RV 基因组(mRNA)表达。(B-C) 偏移直方图显示对Pelareorep 感染高敏感(RPMI-8226、U266)和中等敏感(MM.1S、H929、L363)的细胞系经 CFZ(5 nM)或Pelareorep(5 MOI)单药或联合处理 24 和 48 小时后的 σ- 非结构衣壳蛋白(σ-NS)表达。(D) 代表性流式细胞术图(Annexin V-FITC/PI 染色检测凋亡)显示 MM.1S 细胞经CFZ(2.5 nM)和 RV(5 MOI)单药或联合处理 24-48 小时后的凋亡率(%)。(E-F) 透射电子显微镜(TEM)及定量分析 MM.1S(E)和 RPMI-8226(F)细胞经 CFZ(5 nM)或 Pelareorep(5 MOI)单药或联合处理 24 和 48 小时后的衣壳形成。(G) 柱状图显示 CD138⁺部分(MM细胞)经 CFZ + RV 联合处理 48 小时后存活率(%)显著低于单药组，采用单因素方差分析(**p≤0.01，n=4 例 MM 患者)。(H) 柱状图显示在相同实验条件下，匹配的 CD138⁻部分的细胞活力(%)无显著下降。(I) 健康供体(HD)PBMCs 感染 RV(10 MOI)后 RV 衣壳 mRNA 水平表达(与对照组相比的倍数变化)。(J) 使用 34 抗体 CyTOF panel 生成 FCS 文件，通过 Cytobank© 平台进行层次聚类和统计映射。(K) 柱状图显示(J)中处理条件下的 RV 衣壳信号强度(%)。(L) 复发 / 难治性 MM(RRMM)患者的 PBMCs 经 RV(5 MOI)和 CFZ(2.5 nM)处理并与 MM.1S 细胞共培养 12 小时后，病毒基因组表达的 q-RT-PCR 检测。数据以均值 ±SEM 表示(三次重复)。(M-N) 流式细胞术杀伤实验：使用 RRMM 患者的单核细胞(BM=3 例，PB=2 例)与 GFP⁺ MM.1S 细胞按8:1 比例共培养 24 小时，经 RV(5 MOI)和 CFZ(2.5 nM)单药或联合处理。(O) 柱状图显示RPMI-8226-BTZ 耐药细胞与 HD PBMCs 共培养并经 RV(5 MOI)和 CFZ(5 nM)单药或联合处理后的凋亡诱导情况(与对照相比的倍数变化，独立三次重复)。
当使用包含免疫细胞的骨髓单个核细胞(BM-MNCs)进行共培养时，CFZ+RV联合处理显著降低CD138⁺骨髓瘤细胞的存活率(联合组vsRV单药p=0.01，vsCFZ单药p=0.008，图1G)，而CD138⁻非肿瘤细胞无明显变化(图1H)。这表明PI需通过微环境中的免疫成分间接发挥作用。
单核细胞是RV体内复制与递送的核心载体，PI通过抑制NF-κB解除其抗病毒限制
单细胞质谱流式(CyTOF)分析显示，RV衣壳蛋白(σ-NS)主要表达于经典单核细胞(CD45⁺CD14⁺HLA-DR⁺)，在健康供体和MM患者的外周血单核细胞(PBMCs)中，CD14⁺细胞的σ-NS信号强度显著高于CD14⁻细胞(MM患者p=0.034，健康供体p=0.03，图2A-C)。PI处理后，经典单核细胞内RV基因组复制和衣壳蛋白表达显著增加(CFZ预处理组衣壳计数4605vsRV单药组2890，图2D-E)，而CD14⁻的T细胞、B细胞、NK细胞中未见病毒复制增强(图3I)。
图 2 蛋白酶体抑制剂增强病毒复制依赖单核细胞(A)小提琴图显示 CyTOF 分析 3 例 MM 患者的 σ-NS 信号(*p≤0.05)。(B-C) 使用 34 抗体 CyTOF panel 生成 FCS 文件，通过 Cytobank© 平台进行层次聚类和统计映射。(D-E) MM 患者PBMCs 经 RV(10 MOI)单药或联合 CFZ(2.5 nM)处理后的CyTOF 高保真 FlowSOM 及 t-SNE 热图，显示 RV + CFZ 共处理或预处理后经典单核细胞中 RV 衣壳(σ-NS)检测增加(计数：RV=2890，RV+CFZ 预处理 = 4605，RV+CFZ共处理 = 4702)(D)，不同单核细胞亚群中 RV 绝对计数检测的热图图形表示(E)。(F) RV 感染的HD-PBMCs 或分离的 HD-CD14⁺细胞 24小时后病毒基因组表达的 q-RT-PCR 检测，标准化至对照GAPDH，以均值 ±SEM 表示(三次重复，与 RV 单药相比的倍数变化)。(G) Western blot 分析 HD CD14⁺分选细胞经 PIs(CFZ 和 BTZ，2.5 nM)和 RV 处理 8 小时后的 σ-NS 病毒蛋白表达。(H) 偏移直方图显示流式细胞术检测不同免疫亚群的 JAM-1 表达(实验重复三次独立重复)。(I) CD14⁺细胞与 JAM-1 阻断抗体(10-50-100-150 μg/mL)孵育 1 小时后感染 RV 5 MOI 24 小时，病毒基因组表达的 q-RT-PCR 检测标准化至对照 GAPDH，以均值 ±SEM 表示(三次重复，与 RV 单药相比，****p≤0.0001)。(J) THP-1 细胞经特异性JAM-1 敲低后 Western blot 检测 RV(σNS)蛋白表达。(K) 小鼠实验示意图：(L-M) 小提琴图显示流式细胞术分析处理后小鼠骨髓 RV(σ-NS)衣壳形成(**p≤0.01)(L)及 MM-CD138⁺细胞中的衣壳形成(*p<0.01 和 p≤0.05)(M)。
机制研究发现，RV感染单核细胞后诱导NF-κB通路激活(p65核转位增加，p<0.0001)，而PI可显著抑制这一过程(CFZ处理后p65核转位减少，p<0.0001，图3A-C)。NF-κB抑制导致Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)释放减少(RV+CFZ组IFN-β水平较RV单药组降低60%，p<0.0001，图3K-L)，从而解除单核细胞的抗病毒状态，促进病毒复制。阻断单核细胞表面受体JAM-1后，RV复制显著受损(p<0.0001，图2I-J)，证实单核细胞通过JAM-1介导病毒摄取。
图 3 CFZ 抑制单核细胞介导的抗病毒反应但不影响 T 细胞活化(A)代表性免疫荧光图合并显示 HD 和 RRMM CD14⁺分离细胞经CFZ 处理 30 分钟后感染或未感染 RV(5 MOI)2-4 小时的 p65 染色(绿色)和 DAPI 核酸染色(蓝色)。(B-C) 基于图像的荧光染色强度与像素位置的定量分析，HD 细胞 2 小时(B)和 RRMM CD14⁺细胞 4 小时(C)的 50 个代表性细胞。(D-E) 直方图显示 RV 感染(5 MOI)或未感染的 HD-PBMCs 经不同浓度(1 或 2.5 nM)Bay-11 处理 24小时后的 IFN-α(D)和 IFN-β(E)mRNA 表达，标准化至对照 GAPDH，数据以均值 ±SD 表示(与对照相比的倍数变化)。(F) 流式细胞术杀伤实验：HD PBMCs 与 GFP⁺ MM.1S 细胞按8:1 比例共培养 24 小时，经 RV(5 MOI)和 Bay-11(2.5 nM)单药或联合处理(实验重复三次独立重复)。(G) 柱状图显示杀伤率(7-AAD 阳性 %)，以均值 ±SEM表示。(H) q-RT-PCR 检测(F)相同实验条件下的 RV 衣壳形成，数据标准化并以均值 ±SD 表示(与对照 GAPDH 相比的倍数变化)。(I) THP-1 细胞经Bay-11、BTZ、CFZ(2.5 nM)和 RV(5 MOI)单药或联合处理后的 Western blot 检测 σ-NS 蛋白表达。(J) HEK293 细胞转染NF-κB 荧光素酶报告基因质粒，经 RV(5MOI)和 CFZ(10 nM 和 2.5 nM)处理至 72 小时的荧光素酶报告实验。(K-L) q-RT-PCR 检测 HD PBMCs 经 RV(5 MOI)和 CFZ(2.5 nM)处理不同时间点(2-4-12-24 小时)的 Ⅰ 型干扰素(IFN-α 和IFN-β)诱导情况，数据标准化至对照 GAPDH，以均值±SD 表示(与对照相比的倍数变化)。(M) 多重细胞因子谱热图：HD PBMCs 经 CFZ、RV 或联合处理 4 小时的上清液分析，显示 22 种细胞因子中的 14 种可检测信号。(N-O-P) 质谱流式 t-SNE 热图显示 RRMM 患者新鲜分离 PBMCs 经 RV 感染(10 MOI)和 CFZ 处理(2.5 nM)24 小时后的 CD69 和 CD80 表达。(Q-R) 实时成像显示从 1 例患者分离的 CD14⁺细胞吞噬活性的三个代表性视野，CFZ 处理的巨噬细胞较对照巨噬细胞吞噬能力显著增强(右图示平均荧光强度(MFI)差异)(R)。(S-T) 代表性流式细胞术分析显示 4 例健康供体之一的设门策略，点图(S)显示 RV(5 MOI)+ CFZ(2.5 nM)处理过夜后CD14⁺与 GFP⁺ MM.1S 细胞共定位增加。
在单核细胞耗竭的小鼠模型中，RV感染骨髓瘤细胞的能力显著下降(骨髓RV衣壳阳性细胞比例：对照组26.8%vs耗竭组8.5%，p=0.004，图2L-M)，进一步验证单核细胞是病毒向肿瘤细胞递送的关键载体。
I联合RV重塑免疫微环境，激活CD8⁺T细胞应答
体外实验显示，CFZ+RV处理增强单核细胞对骨髓瘤细胞的吞噬能力(CD14⁺/GFP⁺双阳性细胞比例：联合组32.5%vs对照组4%，p=0.018，图3S-T)，并促进单核细胞表达共刺激分子CD80(图3N-O)。在临床样本中，治疗后外周血经典单核细胞(CD14⁺⁺CD16⁻)计数增加2.3倍(p=0.006，图5A-C)，CD69⁺活化单核细胞比例上升(p=0.047，图5D)。
图 5 RV 联合 PI 诱导免疫激活(A)小提琴图显示纳入 RV + CFZ 1b 期临床试验的复发 MM 患者 PB 的多参数流式细胞术研究，显示总单核细胞绝对计数整体扩增(**p≤0.01)。(B) 线图显示复发 MM 患者 PB 的纵向多参数流式细胞术研究，显示总单核细胞绝对计数随时间变化。(C-D) 小提琴图显示治疗至 C1D9 时 CD14⁺⁺CD16⁻经典单核细胞频率更高(C)及总单核细胞中 CD69 活化标记物增加(p=0.047)(D)，与基线 C1D1相比。(E) 小提琴图显示 4 例治疗前未暴露于 CFZ 的患者与4 例治疗前暴露于 CFZ 的患者相比，PB 单核细胞区室中 CD69 活化标记物轻度增加。(F-G) 小提琴图显示至 C1D9 时CD8 表达增加(F)和 CD4 表达减少(G)，数据以相对于基线的变化 % 表示，Wilcoxon符号秩检验 p 值：*p≤0.05。(H) 小提琴图显示从基线至C1D9 的 CD4/CD8 比值下降，数据以相对于基线的变化% 表示，Wilcoxon 符号秩检验 p 值：*p≤0.05。(I) 使用 Maxpar 直接免疫分析系统对纳入 RV + CFZ 1b 期的 CFZ 耐药患者(RRMM-1)进行纵向深度免疫分析，采用 30 标记抗体干 panel。(J-K-L) 纳入 RV + CFZ 1b 期的 3 例纵向 CFZ 耐药患者的t-SNE 热图，显示治疗后 C1D9(RRMM-1，J)、C1D16(RRMM-2，K)、治疗 4 小时后 C1D1(RRMM-3，L)的选定单核细胞群表达。(M-N-O) 热图显示纳入RV + CFZ 1b 期的 3 例纵向 CFZ 耐药患者的不同单核细胞区室绝对计数。(P-Q-R) 热图显示治疗过程中初始和记忆调节性 T 细胞(Tregs)的总体分布。
T细胞动态方面，治疗后CD8⁺效应记忆T细胞(EMCD8⁺)比例显著增加(治疗2周后占比：联合组35%vs基线18%，p<0.0001，图6F-H)，T细胞克隆性降低(应答患者CDR3多样性指数较非应答者低28%，p=0.06)，提示抗原特异性T细胞扩增。ELISpot实验显示，RV+CFZ处理小鼠的脾细胞在接触RV感染的骨髓瘤细胞时，IFN-γ分泌量增加3倍(p=0.006，图6J-K)，证实功能性细胞免疫应答的激活。
图 6 RV 联合 CFZ 治疗促进针对 MM 细胞的 T 细胞应答(A-B-C)CD8 蛋白 IHC 检测(棕色信号，蓝色复染)显示 PR 患者治疗前(A)和治疗后(B)的变化
1b期临床试验证实联合疗法安全性与有效性，应答与病毒复制及免疫激活相关
在13例PI耐药MM患者中，RV+CFZ联合治疗的客观应答率(ORR)达70%(9/13)，包括2例非常好的部分缓解(VGPR)和4例部分缓解(PR)。剂量水平1(DL1)组ORR更高达83.3%(5/6)，且应答持续时间更长(中位治疗天数331.6天vs低剂量组54.5天)。骨髓检测显示，治疗后RV衣壳蛋白阳性细胞数显著增加(DL1组p=0.028，图4E)，伴随caspase-3激活(p=0.005，图4I)和PD-L1表达上调(p=0.005，图4F-H)，提示病毒复制诱导肿瘤细胞凋亡。
图 4 RV 联合 CFZ 增加 MM 患者骨髓中的病毒复制(A)复发 MM 患者纳入 Pelareorep 联合卡非佐米 1b 期临床试验的治疗方案示意图。(B) 瀑布图显示各患者最佳缓解情况，总缓解率(ORR)为 53.8%(7/13)，临床获益率(CBR)为 69.2%(9/13)。剂量水平 1(DL1)组 ORR 为 83.3%(5/6)，CBR 为 100%，包括非常好的部分缓解(VGPR，n=2)、部分缓解(PR，n=4)、最小缓解(MR，n=1)、稳定疾病(SD，n=3)和进展性疾病(PD，n=1)。剂量水平 - 1(DL-1)组 ORR 为 28.6%(2/7)，CBR 为 42.9%(3/7)。(C-D) 免疫组化(IHC)4 倍放大图像显示单药 RV 和 RV + CFZ 治疗患者治疗前后呼肠孤病毒 RNA(蓝色信号，粉色复染)和呼肠孤病毒衣壳蛋白(棕色信号，蓝色复染)的原位检测数据。(E) 柱状图显示低剂量和标准剂量 CFZ 治疗后骨髓中 σ-NS 蛋白检测(*p=0.028)，每个值代表 200 倍视野下的阳性细胞数。(F) PD-L1 蛋白 IHC 4 倍放大图像(棕色信号，蓝色复染)显示治疗前后变化(n=5)。(G) 免疫荧光 4 倍放大图像显示 PD-L1(红色荧光)和 CD138(绿色荧光)共表达，治疗后 20 倍放大合并图像显示共表达为黄色荧光(比例尺 150 微米)。(H-I) 柱状图显示 RV + CFZ 治疗患者 MM 细胞表面 PD-L1(H)和 Caspase-3(I)较治疗前显著上调(*p=0.005)，单药 RV 治疗患者未观察到该效应。每个值代表 200 倍视野下的阳性细胞数。
安全性方面，主要不良事件为1-2级高血压(38%)和血小板减少(23%)，仅2例出现剂量限制性毒性(血栓性血小板减少和心力衰竭)，显示联合方案耐受性良好。
总结
本研究发现蛋白酶体抑制剂通过“解除单核细胞抗病毒限制”和“激活细胞免疫”双重机制增强溶瘤病毒疗效，突破了PI仅依赖直接细胞毒性的传统认知。研究证实单核细胞是RV在体内的主要复制和递送载体，PI通过抑制NF-κB通路阻断其抗病毒反应，同时重塑免疫微环境，促进单核细胞吞噬功能和CD8⁺T细胞抗肿瘤应答，且该效应与肿瘤细胞对PI的敏感性无关。临床研究在PI耐药患者中验证了联合疗法的有效性，70%应答率显著优于单药数据，为复发/难治性MM提供了“溶瘤病毒+免疫调控”的新治疗模式。未来可探索PI与PD-L1抑制剂联用，克服病毒感染诱导的免疫检查点上调，进一步拓展该疗法在实体瘤中的应用。
参考文献
Dona A A, Tandoh T, Nigam L, et al. Proteasome inhibition enhances oncolytic reovirus therapy in multiple myeloma independently of its direct cytotoxic effects[J]. Journal of Hematology Oncology, 2025, 18(1): 1.
