导语：肝细胞癌(HCC)的发生与肝细胞和微环境的动态互作紧密相关，尽管NK细胞承担着肝脏约50%的免疫监视功能，但当前临床免疫治疗如PD-1抑制剂对HCC疗效有限，尤其在非病毒性病因(如MASH相关HCC)中常因免疫逃逸导致治疗困境。目前该领域缺乏精准生物标志物和有效免疫检查点靶点，难以系统性逆转肿瘤微环境中的NK细胞失活状态。
2025年1月，Signal Transduction and Targeted Therapy发表研究论文“Isoxazole-based molecules restore NK cell immune surveillance in hepatocarcinogenesis by targeting TM4SF5 and SLAMF7 linkage”，聚焦在肝癌组织中高表达的跨膜蛋白TM4SF5，首次提出其通过调控NK细胞功能参与免疫逃逸的机制：TM4SF5通过N-糖基化依赖方式结合NK细胞刺激性配体SLAMF7，诱导其向溶酶体降解，抑制NK细胞杀伤能力，为开发新型NK细胞免疫检查点抑制剂提供了重要靶点。
多模型实验解析分子机制动物研究验证靶向药物效能
本研究是一项结合基础机制验证与动物模型的转化医学研究，旨在阐明TM4SF5调控NK细胞功能的分子路径并评估靶向药物的治疗效果。
研究设计涵盖多维度实验：在细胞模型层面，构建TM4SF5敲除(Huh7KO、Hep3B)及过表达细胞系(SNU761、SNU449T7)，运用免疫印迹、流式细胞术检测NK细胞配体(SLAMF7、MICA/B等)及FAK/c-SRC/STAT3信号通路变化;在动物模型层面，对比野生型(WT)、TM4SF5转基因(TG)及敲除(KO)小鼠的肝癌发生情况，分析肝组织NK细胞数量及穿孔素、颗粒酶表达，并在免疫缺陷小鼠中开展TM4SF5阳性肝癌细胞接种实验，通过异噁唑类化合物(TSIs，如ST-5-002)干预，评估肿瘤体积、SLAMF7表达及溶酶体定位。
分子机制研究借助免疫共沉淀、糖基化突变、溶酶体抑制剂(氯喹)实验，证实TM4SF5与SLAMF7的结合依赖N-糖基化且通过溶酶体途径降解SLAMF7。同时研究分析TCGA肝癌数据，探讨TM4SF5与SLAMF7表达及患者预后的相关性。主要观察指标包括TM4SF5对NK细胞配体表达的调控、TSIs对肿瘤生长的抑制作用，次要指标涉及信号通路激活水平、SLAMF7 亚细胞定位及糖基化修饰影响。
TM4SF5通过多重机制抑制NK细胞功能异噁唑类化合物逆转免疫逃逸
TM4SF5表达与NK细胞活性呈负相关，调控刺激性配体表达
在细胞模型中，TM4SF5过表达显著下调NK细胞刺激性配体SLAMF7、MICA/B的蛋白水平，而敲除内源性TM4SF5后(如Hep3BKO细胞)，上述配体表达显著回升(图1a)。动物实验显示，5月龄TM4SF5转基因(TG)小鼠肝组织中，NK细胞数量虽与野生型(WT)无显著差异，但穿孔素、颗粒酶B活性NK细胞比例分别降低32%和41%(P<0.01，图1c-d)。进一步分析肝癌模型小鼠发现，TM4SF5敲除(KO)小鼠经DEN+CCl诱导后，肿瘤体积较WT小鼠缩小48%，脾脏NK细胞中SLAMF7表达趋势性升高(P=0.076)，提示TM4SF5通过抑制NK细胞配体活性促进肿瘤进展。
临床样本分析显示，超过50%的HCC患者肿瘤组织中TM4SF5呈阳性染色，而正常肝组织、胆管癌及肝转移性腺癌均为阴性(图1e)。TCGA肝癌数据(LIHC队列，n=360)表明，TM4SF5高表达患者的SLAMF7 mRNA水平显著降低，且TM4SF5/SLAMF7亚组的5年总生存率较TM4SF5/SLAMF7亚组降低27%(HR=1.87,P=0.003，图1l)，证实TM4SF5-SLAMF7轴与患者预后密切相关。
图1 TM4SF5介导的NK细胞失活促进肝细胞癌a. 对TM4SF5阴性的SNU761细胞或TM4SF5敲除(Huh7)细胞稳定表达空载体(EV)或TM4SF5(TM)后，进行所示分子的免疫印迹分析。b. 通过流式细胞术对5月龄或1岁龄C57BL/6雌性小鼠肝组织中的CD45< CD3 NK1.1 NK细胞进行免疫染色c,d. 除群体分析(c)外，对NK细胞进行穿孔素(Prf)或颗粒酶(Gzmb)免疫染色(d)。e. 使用抗TM4SF5抗体进行组织微阵列实验显示，超过半数HCC患者组织呈TM4SF5阳性免疫染色，而对应的正常肝组织、胆管癌组织和直肠转移性腺癌组织均为TM4SF5阴性，提示TM4SF5与HCC相关，与其他类型肝癌无关。f. 在雌性WT、Alb-TG TM4SF5-Flag(TG)或Tm4sf5 KO C57BL/6小鼠(n≥5)中进行DEN单独给药47周的肝癌模型构建方案。g,h. 对肝组织中的肝内NK细胞群体及穿孔素(Prf)和颗粒酶(Gzmb)免疫染色进行分析。i. 在WT、Alb-TG TM4SF5-Flag(TG)或Tm4sf5 KO C57BL/6小鼠(n=6)中，进行DEN给药同时给予载体或ST-2-001治疗的肝癌模型构建方案。j. 计数肝脏中体积大于1 mm³的肿瘤数量，并在剔除每组最高和最低值后作图(左，j)。各实验条件下全肝组织的代表性HE染色图像(右，j)。k.对肝组织进行所示分子的免疫组织化学染色。l. 在TCGA的LIHC数据集(n=360，LIHC全体)或TM4SF5表达前25%高表达组(n=90)中，分析基于SLAMF7表达水平(SLAMF7高表达：SLAMF7表达前50%(n=180或45，分别);SLAMF7低表达：SLAMF7表达后50%(n=180或45，分别))的总生存概率，计算风险比(HR)和p值。
TM4SF5通过N-糖基化依赖方式诱导SLAMF7溶酶体降解
机制研究发现，TM4SF5与SLAMF7的结合依赖于SLAMF7的N-糖基化修饰。免疫共沉淀显示，野生型TM4SF5可特异性捕获内源性SLAMF7，而ST-5-001(2.5μM)处理后结合信号完全消失(图4c-d)。通过定点突变SLAMF7的N-糖基化位点(如N172/176/204Q)，发现仅保留N98/142/148Q突变的SLAMF7仍可与TM4SF5结合，而N172/176/204Q突变则完全阻断相互作用(图4e-f)。
图4 TM4SF5与SLAMF7的结合依赖N-糖基化并导致SLAMF7溶酶体降解a,b. 用NK92-EV或NK92-TM4SF5细胞的条件培养基(CM)处理Huh7-HA-EV或Huh7-HA-TM4SF5细胞(a)，或反之(b)24小时后，制备全细胞裂解液并对所示分子进行免疫印迹。c,d. 对表达Strep空载体(Strep-EV)或Strep-TM4SF5(TM)的亚融合SNU761细胞，在未处理(c)或处理(d)DMSO或ST-5-001后收获细胞。e,f. 将SNU761细胞瞬时转染WT或N-糖基化位点(N98、N142、N148、N172、N176和/或N204)的各种SLAMF7突变体后，对所示分子进行免疫印迹(e)或共免疫沉淀(f)。g. 将转染FLAG-SLAMF7和Strep-TM4SF5 WT或Gly的SNU761细胞收获，并用含Brij58的裂解缓冲液裂解。对全细胞裂解液进行链霉亲和素沉淀和免疫印迹。h,i. 将转染Strep-TM4SF5和FLAG-SLAMF7缺失突变体(h)或N-糖基化突变体(i)的SNU761细胞收获，并用含Brij58的裂解缓冲液裂解。对全细胞裂解液进行链霉亲和素沉淀和免疫印迹。j. 将SNU761细胞与HA-TM4SF5一起转染FLAG-SLAMF7 WT、NQ#6或NQ#456 N-糖基化突变的SLAMF7;NQ：N98Q，NQ*2：N142Q，NQ#：N148Q，NQ#123：N98/142/148Q，NQ#456：N172/176/204Q，NQ#14567：N98/172/176/204Q，NQ#24567：N142/172/176/204Q，NQ#23456：N142/148/172/176/204Q。
亚细胞定位实验显示，TM4SF5与SLAMF7共定位于溶酶体标志物LAMP1区域，而氯喹(10μM)抑制溶酶体功能后，SLAMF7降解被完全阻断(图5d)。这表明TM4SF5通过识别SLAMF7的N172/176/204糖基化位点，介导其内化并转运至溶酶体降解。
图5 TM4SF5通过溶酶体转运依赖方式下调SLAMF7a. 对表达FLAG-SLAMF7和HA-EV或HA-TM4SF5的SNU761细胞，在4°C孵育后，再在37°C孵育所示时间。b,c. 将SNU761细胞转染HA-TM4SF5和FLAG-SLAMF7后，用HA、FLAG和LAMP1或ZO-1抗体进行免疫染色。d. 将转染FLAG-SLAMF7和HA-EV或HA-TM4SF5的SNU761细胞，用ST-5-002处理并加或不加氯喹(CQ，10μM)24小时。收获细胞并对所示抗体进行免疫印迹。e–h. 将转染Strep-TM4SF5和FLAG-SLAMF7的SNU761细胞用ST-5-002(e)或ST-3-001(f)处理24小时。
异噁唑类化合物(TSIs)阻断TM4SF5-SLAMF7相互作用，恢复NK细胞功能
结构优化的TSIs(如ST-5-002)可显著抑制TM4SF5介导的信号通路激活。在SNU449T7细胞中，ST-5-002(2.5μM)处理24小时后，FAK(pY397)、c-SRC(pY416)、STAT3(pY705)磷酸化水平分别降低78%、65%、82%(图2d)。
图2 异噁唑类化合物通过抑制依赖TM4SF5表达的信号活性消除肝癌发展a. 在NOD-SCID雄性小鼠(6周龄，n=10)中构建表达TM4SF5的SNU449T7细胞异种移植模型的方案。b. 每周两次用卡尺测量肿瘤体积并计算。处死小鼠并提取肿瘤后立即测量肿瘤重量。c. 对肝组织进行所示分子的免疫染色。显示代表性图像。d. 对亚融合状态的TM4SF5阴性SNU449Cp(Cp)或TM4SF5阳性SNU449T7细胞用载体或异噁唑类化合物(3μM)处理24小时后，收获并进行免疫印迹。
在免疫缺陷小鼠xenograft模型中，ST-5-002(2.5mpk)治疗组肿瘤体积较对照组缩小62%(P<0.0001)，且肝组织中SLAMF7细胞从肿瘤边缘向内部弥散分布(图6i)。
图6 抗TM4SF5异噁唑类化合物恢复SLAMF7阳性细胞群体以阻断HCC模型中的细胞生长a. 在NOD-SCID雄性小鼠(6周龄，n=8)中构建HCC PDX异种移植模型的方案。b. 肿瘤接种36天后，从小鼠右胁腹提取肿瘤。c. 每周两次用卡尺测量肿瘤大小。处死小鼠并提取肿瘤后测量肿瘤重量。d. 对肿瘤组织进行所示分子的免疫染色。显示代表性图像。e,f. 对HCC患者组织 [两例TM4SF5阳性病例(#7和#17，红色);两例TM4SF5阴性病例(#12和#15，蓝色);一例TM4SF5未升高病例(#8，灰色)] 进行TM4SF5和SLAMF7免疫印迹(e)。g. 在雄性BALB/c-Nude小鼠(n=9)中进行肝原位SNU449T7细胞植入的HCC模型实验方案。h. 在肝原位SNU449T7异种移植实验期间的体重和最大肿瘤体积变化。i. 对接受载体或ST-5-002治疗的小鼠的肿瘤肝组织进行Slamf7免疫染色的图像。j. 用针对NK细胞配体的抗体对肝组织进行免疫组织化学分析。
机制上，TSIs通过与TM4SF5的Arg113形成氢键、与Trp142形成π-π堆积(结合能-46.66kcal/mol)，阻断其与SLAMF7的结合，使SLAMF7保留于细胞膜(图7b-c)。在免疫功能正常的C57BL/6小鼠中，ST-5-002逆转TM4SF5诱导的肝内NK细胞失活，使颗粒酶BNK细胞比例从18%升至35%(P<0.01)。
图7 TM4SF5蛋白与TSIs的相互作用界面a–c. TM4SF5与TSI结合的结构建模。a. TM4SF5的结构模型(带状形式)，模拟的磷脂膜(棒状形式)与蛋白腔面的对接结果一起描绘。b,c. ST-5-001(b)和ST-5-002(c)的优化对接模型显示，异噁唑类化合物嵌入TM4SF5腔面的长细胞外环区域。d,e. 在HEK293FT细胞或Huh7细胞中，对下拉(PD)或免疫沉淀(IP)的Strep-TM4SF5(左)或HA-TM4SF5(右)与C-ST-5-002的结合进行测定，反应混合物先与冷ST-5-002预处理1小时。f. TSIs对TM4SF5介导的SLAMF7下调和NK细胞失活的抑制作用模型。
临床前模型验证 TSIs 的治疗潜力与安全性
在人源肝癌PDX模型中，ST-5-002(5mpk)治疗组肿瘤重量较对照组降低59%(P<0.01，图6b-c)，且未观察到体重下降等毒性反应。免疫组化显示，TSIs处理组肿瘤组织中Ki67增殖细胞减少41%，而SLAMF7细胞面积扩大2.3倍(图6d)。进一步分析HCC患者肝组织发现，TM4SF5阳性肿瘤中，SLAMF7与LAMP1的共免疫沉淀信号显著强于癌旁组织，而TSIs处理可减少二者共定位(图6e-f)，印证TM4SF5-SLAMF7-溶酶体轴在人类肝癌中的病理作用。
总结
本研究系统揭示HCC中TM4SF5通过降解NK细胞刺激性配体SLAMF7介导免疫逃逸的机制，并验证异噁唑类化合物通过阻断TM4SF5-SLAMF7相互作用、恢复NK细胞功能的治疗潜力。研究的独特价值体现在：首次将TM4SF5定义为NK细胞免疫检查点，为非病毒性HCC提供特异性靶点;异噁唑类化合物经结构优化实现对TM4SF5的高选择性抑制，在多种动物模型中表现出低毒性和抗肿瘤活性，具临床转化前景;TM4SF5-SLAMF7轴可作为HCC患者分层的生物标志物，指导个性化免疫治疗。未来需进一步验证TSIs在人类肝癌中的安全性与有效性，探索其与现有免疫疗法的联合应用可能，为HCC治疗提供更全面策略。
参考文献
Kim J E, Kim H S, Kim W, et al. Isoxazole-based molecules restore NK cell immune surveillance in hepatocarcinogenesis by targeting TM4SF5 and SLAMF7 linkage[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2025, 10(1): 15.
导语：肝细胞癌(HCC)的发生与肝细胞和微环境的动态互作紧密相关，尽管NK细胞承担着肝脏约50%的免疫监视功能，但当前临床免疫治疗如PD-1抑制剂对HCC疗效有限，尤其在非病毒性病因(如MASH相关HCC)中常因免疫逃逸导致治疗困境。目前该领域缺乏精准生物标志物和有效免疫检查点靶点，难以系统性逆转肿瘤微环境中的NK细胞失活状态。
2025年1月，Signal Transduction and Targeted Therapy发表研究论文“Isoxazole-based molecules restore NK cell immune surveillance in hepatocarcinogenesis by targeting TM4SF5 and SLAMF7 linkage”，聚焦在肝癌组织中高表达的跨膜蛋白TM4SF5，首次提出其通过调控NK细胞功能参与免疫逃逸的机制：TM4SF5通过N-糖基化依赖方式结合NK细胞刺激性配体SLAMF7，诱导其向溶酶体降解，抑制NK细胞杀伤能力，为开发新型NK细胞免疫检查点抑制剂提供了重要靶点。
多模型实验解析分子机制动物研究验证靶向药物效能
本研究是一项结合基础机制验证与动物模型的转化医学研究，旨在阐明TM4SF5调控NK细胞功能的分子路径并评估靶向药物的治疗效果。
研究设计涵盖多维度实验：在细胞模型层面，构建TM4SF5敲除(Huh7KO、Hep3B)及过表达细胞系(SNU761、SNU449T7)，运用免疫印迹、流式细胞术检测NK细胞配体(SLAMF7、MICA/B等)及FAK/c-SRC/STAT3信号通路变化;在动物模型层面，对比野生型(WT)、TM4SF5转基因(TG)及敲除(KO)小鼠的肝癌发生情况，分析肝组织NK细胞数量及穿孔素、颗粒酶表达，并在免疫缺陷小鼠中开展TM4SF5阳性肝癌细胞接种实验，通过异噁唑类化合物(TSIs，如ST-5-002)干预，评估肿瘤体积、SLAMF7表达及溶酶体定位。
分子机制研究借助免疫共沉淀、糖基化突变、溶酶体抑制剂(氯喹)实验，证实TM4SF5与SLAMF7的结合依赖N-糖基化且通过溶酶体途径降解SLAMF7。同时研究分析TCGA肝癌数据，探讨TM4SF5与SLAMF7表达及患者预后的相关性。主要观察指标包括TM4SF5对NK细胞配体表达的调控、TSIs对肿瘤生长的抑制作用，次要指标涉及信号通路激活水平、SLAMF7 亚细胞定位及糖基化修饰影响。
TM4SF5通过多重机制抑制NK细胞功能异噁唑类化合物逆转免疫逃逸
TM4SF5表达与NK细胞活性呈负相关，调控刺激性配体表达
在细胞模型中，TM4SF5过表达显著下调NK细胞刺激性配体SLAMF7、MICA/B的蛋白水平，而敲除内源性TM4SF5后(如Hep3BKO细胞)，上述配体表达显著回升(图1a)。动物实验显示，5月龄TM4SF5转基因(TG)小鼠肝组织中，NK细胞数量虽与野生型(WT)无显著差异，但穿孔素、颗粒酶B活性NK细胞比例分别降低32%和41%(P<0.01，图1c-d)。进一步分析肝癌模型小鼠发现，TM4SF5敲除(KO)小鼠经DEN+CCl诱导后，肿瘤体积较WT小鼠缩小48%，脾脏NK细胞中SLAMF7表达趋势性升高(P=0.076)，提示TM4SF5通过抑制NK细胞配体活性促进肿瘤进展。
临床样本分析显示，超过50%的HCC患者肿瘤组织中TM4SF5呈阳性染色，而正常肝组织、胆管癌及肝转移性腺癌均为阴性(图1e)。TCGA肝癌数据(LIHC队列，n=360)表明，TM4SF5高表达患者的SLAMF7 mRNA水平显著降低，且TM4SF5/SLAMF7亚组的5年总生存率较TM4SF5/SLAMF7亚组降低27%(HR=1.87,P=0.003，图1l)，证实TM4SF5-SLAMF7轴与患者预后密切相关。
图1 TM4SF5介导的NK细胞失活促进肝细胞癌a. 对TM4SF5阴性的SNU761细胞或TM4SF5敲除(Huh7)细胞稳定表达空载体(EV)或TM4SF5(TM)后，进行所示分子的免疫印迹分析。b. 通过流式细胞术对5月龄或1岁龄C57BL/6雌性小鼠肝组织中的CD45< CD3 NK1.1 NK细胞进行免疫染色c,d. 除群体分析(c)外，对NK细胞进行穿孔素(Prf)或颗粒酶(Gzmb)免疫染色(d)。e. 使用抗TM4SF5抗体进行组织微阵列实验显示，超过半数HCC患者组织呈TM4SF5阳性免疫染色，而对应的正常肝组织、胆管癌组织和直肠转移性腺癌组织均为TM4SF5阴性，提示TM4SF5与HCC相关，与其他类型肝癌无关。f. 在雌性WT、Alb-TG TM4SF5-Flag(TG)或Tm4sf5 KO C57BL/6小鼠(n≥5)中进行DEN单独给药47周的肝癌模型构建方案。g,h. 对肝组织中的肝内NK细胞群体及穿孔素(Prf)和颗粒酶(Gzmb)免疫染色进行分析。i. 在WT、Alb-TG TM4SF5-Flag(TG)或Tm4sf5 KO C57BL/6小鼠(n=6)中，进行DEN给药同时给予载体或ST-2-001治疗的肝癌模型构建方案。j. 计数肝脏中体积大于1 mm³的肿瘤数量，并在剔除每组最高和最低值后作图(左，j)。各实验条件下全肝组织的代表性HE染色图像(右，j)。k.对肝组织进行所示分子的免疫组织化学染色。l. 在TCGA的LIHC数据集(n=360，LIHC全体)或TM4SF5表达前25%高表达组(n=90)中，分析基于SLAMF7表达水平(SLAMF7高表达：SLAMF7表达前50%(n=180或45，分别);SLAMF7低表达：SLAMF7表达后50%(n=180或45，分别))的总生存概率，计算风险比(HR)和p值。
TM4SF5通过N-糖基化依赖方式诱导SLAMF7溶酶体降解
机制研究发现，TM4SF5与SLAMF7的结合依赖于SLAMF7的N-糖基化修饰。免疫共沉淀显示，野生型TM4SF5可特异性捕获内源性SLAMF7，而ST-5-001(2.5μM)处理后结合信号完全消失(图4c-d)。通过定点突变SLAMF7的N-糖基化位点(如N172/176/204Q)，发现仅保留N98/142/148Q突变的SLAMF7仍可与TM4SF5结合，而N172/176/204Q突变则完全阻断相互作用(图4e-f)。
图4 TM4SF5与SLAMF7的结合依赖N-糖基化并导致SLAMF7溶酶体降解a,b. 用NK92-EV或NK92-TM4SF5细胞的条件培养基(CM)处理Huh7-HA-EV或Huh7-HA-TM4SF5细胞(a)，或反之(b)24小时后，制备全细胞裂解液并对所示分子进行免疫印迹。c,d. 对表达Strep空载体(Strep-EV)或Strep-TM4SF5(TM)的亚融合SNU761细胞，在未处理(c)或处理(d)DMSO或ST-5-001后收获细胞。e,f. 将SNU761细胞瞬时转染WT或N-糖基化位点(N98、N142、N148、N172、N176和/或N204)的各种SLAMF7突变体后，对所示分子进行免疫印迹(e)或共免疫沉淀(f)。g. 将转染FLAG-SLAMF7和Strep-TM4SF5 WT或Gly的SNU761细胞收获，并用含Brij58的裂解缓冲液裂解。对全细胞裂解液进行链霉亲和素沉淀和免疫印迹。h,i. 将转染Strep-TM4SF5和FLAG-SLAMF7缺失突变体(h)或N-糖基化突变体(i)的SNU761细胞收获，并用含Brij58的裂解缓冲液裂解。对全细胞裂解液进行链霉亲和素沉淀和免疫印迹。j. 将SNU761细胞与HA-TM4SF5一起转染FLAG-SLAMF7 WT、NQ#6或NQ#456 N-糖基化突变的SLAMF7;NQ：N98Q，NQ*2：N142Q，NQ#：N148Q，NQ#123：N98/142/148Q，NQ#456：N172/176/204Q，NQ#14567：N98/172/176/204Q，NQ#24567：N142/172/176/204Q，NQ#23456：N142/148/172/176/204Q。
亚细胞定位实验显示，TM4SF5与SLAMF7共定位于溶酶体标志物LAMP1区域，而氯喹(10μM)抑制溶酶体功能后，SLAMF7降解被完全阻断(图5d)。这表明TM4SF5通过识别SLAMF7的N172/176/204糖基化位点，介导其内化并转运至溶酶体降解。
图5 TM4SF5通过溶酶体转运依赖方式下调SLAMF7a. 对表达FLAG-SLAMF7和HA-EV或HA-TM4SF5的SNU761细胞，在4°C孵育后，再在37°C孵育所示时间。b,c. 将SNU761细胞转染HA-TM4SF5和FLAG-SLAMF7后，用HA、FLAG和LAMP1或ZO-1抗体进行免疫染色。d. 将转染FLAG-SLAMF7和HA-EV或HA-TM4SF5的SNU761细胞，用ST-5-002处理并加或不加氯喹(CQ，10μM)24小时。收获细胞并对所示抗体进行免疫印迹。e–h. 将转染Strep-TM4SF5和FLAG-SLAMF7的SNU761细胞用ST-5-002(e)或ST-3-001(f)处理24小时。
异噁唑类化合物(TSIs)阻断TM4SF5-SLAMF7相互作用，恢复NK细胞功能
结构优化的TSIs(如ST-5-002)可显著抑制TM4SF5介导的信号通路激活。在SNU449T7细胞中，ST-5-002(2.5μM)处理24小时后，FAK(pY397)、c-SRC(pY416)、STAT3(pY705)磷酸化水平分别降低78%、65%、82%(图2d)。
图2 异噁唑类化合物通过抑制依赖TM4SF5表达的信号活性消除肝癌发展a. 在NOD-SCID雄性小鼠(6周龄，n=10)中构建表达TM4SF5的SNU449T7细胞异种移植模型的方案。b. 每周两次用卡尺测量肿瘤体积并计算。处死小鼠并提取肿瘤后立即测量肿瘤重量。c. 对肝组织进行所示分子的免疫染色。显示代表性图像。d. 对亚融合状态的TM4SF5阴性SNU449Cp(Cp)或TM4SF5阳性SNU449T7细胞用载体或异噁唑类化合物(3μM)处理24小时后，收获并进行免疫印迹。
在免疫缺陷小鼠xenograft模型中，ST-5-002(2.5mpk)治疗组肿瘤体积较对照组缩小62%(P<0.0001)，且肝组织中SLAMF7细胞从肿瘤边缘向内部弥散分布(图6i)。
图6 抗TM4SF5异噁唑类化合物恢复SLAMF7阳性细胞群体以阻断HCC模型中的细胞生长a. 在NOD-SCID雄性小鼠(6周龄，n=8)中构建HCC PDX异种移植模型的方案。b. 肿瘤接种36天后，从小鼠右胁腹提取肿瘤。c. 每周两次用卡尺测量肿瘤大小。处死小鼠并提取肿瘤后测量肿瘤重量。d. 对肿瘤组织进行所示分子的免疫染色。显示代表性图像。e,f. 对HCC患者组织 [两例TM4SF5阳性病例(#7和#17，红色);两例TM4SF5阴性病例(#12和#15，蓝色);一例TM4SF5未升高病例(#8，灰色)] 进行TM4SF5和SLAMF7免疫印迹(e)。g. 在雄性BALB/c-Nude小鼠(n=9)中进行肝原位SNU449T7细胞植入的HCC模型实验方案。h. 在肝原位SNU449T7异种移植实验期间的体重和最大肿瘤体积变化。i. 对接受载体或ST-5-002治疗的小鼠的肿瘤肝组织进行Slamf7免疫染色的图像。j. 用针对NK细胞配体的抗体对肝组织进行免疫组织化学分析。
机制上，TSIs通过与TM4SF5的Arg113形成氢键、与Trp142形成π-π堆积(结合能-46.66kcal/mol)，阻断其与SLAMF7的结合，使SLAMF7保留于细胞膜(图7b-c)。在免疫功能正常的C57BL/6小鼠中，ST-5-002逆转TM4SF5诱导的肝内NK细胞失活，使颗粒酶BNK细胞比例从18%升至35%(P<0.01)。
图7 TM4SF5蛋白与TSIs的相互作用界面a–c. TM4SF5与TSI结合的结构建模。a. TM4SF5的结构模型(带状形式)，模拟的磷脂膜(棒状形式)与蛋白腔面的对接结果一起描绘。b,c. ST-5-001(b)和ST-5-002(c)的优化对接模型显示，异噁唑类化合物嵌入TM4SF5腔面的长细胞外环区域。d,e. 在HEK293FT细胞或Huh7细胞中，对下拉(PD)或免疫沉淀(IP)的Strep-TM4SF5(左)或HA-TM4SF5(右)与C-ST-5-002的结合进行测定，反应混合物先与冷ST-5-002预处理1小时。f. TSIs对TM4SF5介导的SLAMF7下调和NK细胞失活的抑制作用模型。
临床前模型验证 TSIs 的治疗潜力与安全性
在人源肝癌PDX模型中，ST-5-002(5mpk)治疗组肿瘤重量较对照组降低59%(P<0.01，图6b-c)，且未观察到体重下降等毒性反应。免疫组化显示，TSIs处理组肿瘤组织中Ki67增殖细胞减少41%，而SLAMF7细胞面积扩大2.3倍(图6d)。进一步分析HCC患者肝组织发现，TM4SF5阳性肿瘤中，SLAMF7与LAMP1的共免疫沉淀信号显著强于癌旁组织，而TSIs处理可减少二者共定位(图6e-f)，印证TM4SF5-SLAMF7-溶酶体轴在人类肝癌中的病理作用。
总结
本研究系统揭示HCC中TM4SF5通过降解NK细胞刺激性配体SLAMF7介导免疫逃逸的机制，并验证异噁唑类化合物通过阻断TM4SF5-SLAMF7相互作用、恢复NK细胞功能的治疗潜力。研究的独特价值体现在：首次将TM4SF5定义为NK细胞免疫检查点，为非病毒性HCC提供特异性靶点;异噁唑类化合物经结构优化实现对TM4SF5的高选择性抑制，在多种动物模型中表现出低毒性和抗肿瘤活性，具临床转化前景;TM4SF5-SLAMF7轴可作为HCC患者分层的生物标志物，指导个性化免疫治疗。未来需进一步验证TSIs在人类肝癌中的安全性与有效性，探索其与现有免疫疗法的联合应用可能，为HCC治疗提供更全面策略。
参考文献
Kim J E, Kim H S, Kim W, et al. Isoxazole-based molecules restore NK cell immune surveillance in hepatocarcinogenesis by targeting TM4SF5 and SLAMF7 linkage[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2025, 10(1): 15.
