导语:肝细胞癌(HCC)作为全球癌症相关死亡的第四大病因,其治疗困境尤为突出——即便采用手术切除,患者术后复发率仍居高不下,而免疫检查点阻断(ICB)疗法虽带来希望,却仅能使少数患者获益。这一现状的核心挑战在于肿瘤微环境(TME)对CD8⁺T细胞功能的抑制,以及肿瘤细胞通过代谢重编程逃避免疫监视。例如,TME中的葡萄糖剥夺和缺氧会导致CD8⁺T细胞代谢效率低下、功能耗竭,而肿瘤细胞的异常糖酵解又进一步加剧了这一恶性循环。
在这一背景下,RNA结合蛋白SRSF1的潜在作用逐渐浮出水面。已有研究表明,SRSF1在多种肿瘤中高表达,通过调控基因剪接促进肿瘤进展,但其在肿瘤微环境中对CD8⁺T细胞功能的影响却鲜少被探索。2025年1月,Signal Transduction and Targeted Therapy发表了一篇题为“Targeting SRSF1 improves cancer immunotherapy by dually acting on CD8⁺ T and tumor cells”的文章,首次揭示了SRSF1在肿瘤细胞和CD8⁺T细胞中的双重调控机制,为突破免疫治疗瓶颈提供了新视角。
多维度实验揭示双重机制新型抑制剂验证治疗潜力
本研究是一项基础与转化结合的实验研究,旨在通过体内外模型阐明SRSF1对肿瘤免疫的双重作用,并开发靶向药物。研究者首先通过临床样本和公共数据库分析发现,SRSF1表达与CD8⁺T细胞耗竭标志物呈正相关,且在ICB治疗无响应的肿瘤中显著升高。随后构建SRSF1条件性敲除小鼠(Srsf1fl/flCd4-Cre),特异性删除CD4⁺/CD8⁺T细胞中的SRSF1,观察其对肿瘤生长和T细胞功能的影响。同时,利用shRNA敲低肿瘤细胞中的SRSF1,结合转录组、代谢组学分析其对糖酵解通路的调控。
为验证靶向药物潜力,研究者通过虚拟筛选和体外实验开发了小分子抑制剂TN2008,并在HCC和黑色素瘤小鼠模型中评估其单药及联合抗PD-1治疗的效果。主要评价指标包括肿瘤体积变化、CD8⁺T细胞浸润及功能表型(如CD38⁺、IFN-γ⁺细胞比例)、糖酵解代谢物水平(如乳酸、葡萄糖摄取)等,次要指标涉及TME中调节性T细胞(Tregs)和髓源性抑制细胞(MDSCs)的比例变化。
双重机制突破代谢屏障联合治疗逆转免疫耐药
RSF1高表达与CD8⁺T细胞耗竭及免疫治疗无响应密切相关
通过分析TCGA和GTEx数据库,研究者发现SRSF1mRNA在31种肿瘤中的15种显著上调。ESTIMATE算法显示,SRSF1表达与耗竭型CD8⁺T细胞(如LAYN⁺细胞)呈正相关,与细胞毒性/记忆性T细胞呈负相关,且与T细胞耗竭特征基因(如PD-1、CTLA-4)表达显著正相关。在结直肠癌(CRC)和肾细胞癌(RCC)的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据中,肿瘤内CD8⁺T细胞的SRSF1表达显著高于癌旁组织。
进一步对7例人类HCC样本和5例小鼠HCC模型的scRNA-seq分析显示,肿瘤内耗竭型CD8⁺T细胞(TIGIT⁺表型)的SRSF1蛋白和mRNA水平均显著高于效应型CD8⁺T细胞(图1b-f)。在抗PD-1治疗无响应的HCC患者中,肿瘤内CD8⁺T细胞的SRSF1表达显著升高(图1m),基底细胞癌数据库亦验证了这一趋势。
图1 SRSF1水平与CD8⁺T细胞耗竭表型相关a 单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析流程示意图。b 人类CD8⁺T细胞各簇的UMAP可视化:簇0、1、6为naive CD8⁺T细胞;簇2为效应CD8⁺T细胞;簇3、4、5为耗竭CD8⁺T细胞。c 点图显示各细胞簇中SRSF1及T细胞标记基因的表达水平。d 散点图显示细胞毒性与耗竭CD8⁺T细胞之间的差异表达基因(DEGs)。e 小鼠CD8⁺T细胞簇的UMAP图:簇0为耗竭CD8⁺T细胞;簇1、2、3、4、6为naiveCD8⁺T细胞;簇5为效应CD8⁺T细胞。f 点图显示不同细胞簇的标记基因。g 肿瘤及正常组织中耗竭CD8⁺T细胞的SRSF1表达。h Western blot显示耗竭CD8⁺T细胞中的SRSF1表达高于活化CD8⁺T细胞。i 接受新辅助抗PD-1治疗的HCC患者scRNA-seq分析流程示意图。j 人类CD8⁺T细胞各簇的UMAP可视化。k UMAP图显示抗PD-1无响应组与响应组之间的簇差异。l 柱状图显示抗PD-1无响应组与响应组中不同CD8⁺T细胞簇的比例。m 无响应组与响应组中耗竭CD8⁺T细胞的SRSF1表达比较。
CD8⁺T细胞缺失SRSF1可增强其效应功能及过继治疗效果
构建Srsf1条件性敲除小鼠(Srsf1fl/flCd4-Cre)后,CD8⁺T细胞中SRSF1蛋白完全缺失(图2a)。在CTNNB1;Trp53诱导的HCC模型中,敲除组小鼠的肿瘤体积较对照组减少45%,肝/体重比降低32%,生存期延长35%(图2c-e)。scRNA-seq显示,敲除组肿瘤内效应型CD8⁺T细胞(CD44⁺CD62L⁻)比例增加2.3倍,CD38⁺CD8⁺T细胞(活化表型)显著富集(图2f-i),且IFN-γ⁺、GZMB⁺细胞比例提升(图2j)。
过继转移实验中,SRSF1敲除的OT-ICD8⁺T细胞可使Hep1-6-OVA肿瘤生长抑制率达68%,小鼠存活率提升50%。与抗PD-1联合使用时,在Hepa1-6和B16F10模型中,肿瘤体积较单药组再减少30%-40%,CD38⁺CD8⁺T细胞比例增加至对照组的2.8倍(图2k-m)。
图2 CD8⁺T细胞中SRSF1缺失增强其细胞毒性a CD8⁺T细胞中条件性敲除Srsf1的示意图及两组CD8⁺T细胞的SRSF1表达。b,c Srsf1Cd4-Cre 与 Srsf1+/+Cd4-Cre小鼠的HCC进展比较(每组n=6)。d 两组小鼠的肿瘤数量(左)和肝/体重比(右)分析(每组n=6)。e Kaplan-Meier生存分析(每组n=6)。f,g 小鼠HCC组织T细胞的UMAP图:NC为 Srsf1+/+Cd4-Cre组,KO为Srsf1Cd4-Cre组。h 两组小鼠的T细胞亚群比例分析(每组n=3)。i scRNA-seq数据显示CD38在两组小鼠中的表达及分布差异。j UMAP图中GZMK的表达(来自scRNA-seq分析)。k HCC或B16F10肿瘤模型联合PD-1治疗的示意图(Hep1-6或B16F10细胞:2×10⁵)及CD8⁺T细胞中SRSF1敲除与PD-1治疗的协同作用。l,m 流式细胞术显示Srsf1fl/flCd4-Cre小鼠肿瘤中CD38⁺CD8⁺T细胞(l)和效应CD8⁺T细胞(CD44⁺CD62LlowCD8⁺,m)比例显著高于对照组。
RSF1通过调控FOXO1和mTOR通路增强CD8⁺T细胞糖酵解代谢
RNA测序显示,SRSF1敲除的CD8⁺T细胞中,糖酵解相关基因(如HK2、PFKP)和mTOR通路基因(如AKT、S6)显著上调(图3b-e)。Westernblot证实,敲除组PTEN蛋白减少40%,磷酸化S6(pS6)增加60%,提示mTORC1通路激活(图3g)。抑制mTOR(雷帕霉素处理)可逆转糖酵解增强和IFN-γ分泌(图3h,i)。
机制上,SRSF1通过RRM1结构域结合PTEN的3'UTR,敲除后PTENmRNA稳定性下降55%(图3j)。转录因子分析显示,FOXO1是CD38上调的关键调控因子——敲除SRSF1可使FOXO1蛋白增加70%,而敲低FOXO1则完全逆转CD38表达(图3k-m)。进一步发现,SRSF1通过结合NLK的3'UTR稳定其mRNA,敲除后NLK蛋白减少50%,解除对FOXO1的核输出抑制(图3o-p)。
图3 CD8⁺T细胞中SRSF1缺失通过调控FOXO1增加CD38表达a Srsf1+/+CD8⁺T细胞与Srsf1−/−CD8⁺T细胞的DEGs热图(上调/下调基因)。b CD8⁺T细胞的KEGG分析(Srsf1+/+CD8⁺T vs Srsf1−/−CD8⁺T)。c-e CD8⁺T细胞的基因簇分析(Srsf1+/+CD8⁺T vs Srsf1−/−CD8⁺T)。f qPCR分析 Srsf1+/+CD8⁺T细胞与Srsf1−/−CD8⁺T细胞的细胞毒性基因表达。g Western blot显示Srsf1−/−CD8⁺T细胞与Srsf1+/+CD8⁺T细胞中PTEN和S6的表达。h 雷帕霉素处理对Srsf1−/−CD8⁺T细胞效应表型比例的影响。i Seahorse实验显示CD8⁺T细胞缺失Srsf1可增加糖酵解代谢,且可被mTOR抑制剂逆转。j 荧光素酶分析显示SRSF1-RRM1结合PTEN mRNA的3'UTR。k SRSF1-KO CD8⁺T细胞中上调的转录因子(TF)与mTOR通路相关TF的交集结果(KO:敲除)。l scRNA-seq分析中FOXO1的UMAP表达图。m Western blot显示Foxo1沉默后CD38和Foxo1蛋白水平在Srsf1+/+和Srsf1−/−CD8⁺T细胞中的变化。n ChIP实验显示Foxo1在转录水平上调Cd38。o Western blot显示Srsf1−/−CD8⁺T细胞中Nlk表达下调。p 荧光素酶分析显示SRSF1-RRM1结合Nlk mRNA的3'UTR。q 对照组与Srsf1+/-CD8⁺T细胞中Nlk、Foxo1和Pten的mRNA表达比较。
肿瘤细胞缺失SRSF1可抑制糖酵解并解除对CD8⁺T细胞的代谢抑制 在Hep1-6-OVA细胞中敲低SRSF1(shSRSF1),糖酵解能力(Seahorse检测)下降42%,葡萄糖摄取(18F-FDG)减少35%,乳酸生成降低51%。代谢组学显示,糖酵解中间产物(如PGK1、PGAM1)水平显著下调。转录因子分析发现,SRSF1通过RRM1结合c-Myc、c-Jun、JunB的3'UTR,敲低后三者mRNA稳定性下降60%-70%,蛋白水平减少50%-65%(图4g-i)。
图4 肿瘤内源性SRSF1缺失通过下调bZIP转录因子和c-Myc抑制糖酵解a SRSF1下调基因的KEGG分析。b SRSF1调控的可变剪接事件(AS events)的KEGG分析。c,d Western blot和qPCR显示SRSF1调控糖酵解基因。e,f SRSF1-RIP-seq峰在5'UTR、CDS和内含子区域的富集情况(根据基因组元件分布分类并与基因组背景比较)。g RIP实验显示SRSF1结合c-Myc、c-Jun和JunB。h,i PCR和Western blot显示SRSF1调控c-Myc、c-Jun和JunB转录因子。j SRSF1及其结构域缺失突变体(ΔRRM1、ΔRRM2、ΔRS)的示意图。k Western blot分析SRSF1-sh细胞中转染内源性/外源性SRSF1(HA标记)的转录因子表达(突变体包括ΔRRM1、ΔRRM2、ΔRS)。l-n SRSF1通过结合mRNA的3'UTR保护c-Myc、c-Jun和JunB转录因子(ActD处理后mRNA稳定性分析)。
共培养实验中,shSRSF1肿瘤细胞与OT-ICD8⁺T细胞共孵育8小时后,T细胞中IFN-γ⁺、GZMB⁺细胞比例增加至对照组的2.1倍,细胞毒性(台盼蓝染色)提升48%。在免疫缺陷小鼠中,shSRSF1肿瘤生长抑制率仅为22%,而在野生型小鼠中达58%,提示T细胞依赖性抗肿瘤效应。
小分子抑制剂TN2008靶向SRSF1可协同抗PD-1治疗逆转免疫耐药
通过虚拟筛选和体外验证,开发出SRSF1抑制剂TN2008(IC50=144μM),其与SRSF1的RRM1结构域结合能为-5.1kcal/mol,特异性结合野生型SRSF1(Kd=5.13×10⁻⁶M),对突变型(GLU44/PRO48等位点突变)结合力下降7倍(图5i-n)。在HCC类器官与CD8⁺T细胞共培养模型中,TN2008使肿瘤生长抑制率达65%(图5e-f)。
图5 SRSF1抑制剂TN2008的鉴定a SRSF1抑制剂筛选流程示意图。b 体外增殖实验筛选出的前10名SRSF1抑制剂候选化合物。c SRSF1抑制剂作用于CD8⁺T细胞的示意图。d 热图显示SRSF1抑制剂上调CD8⁺T细胞的细胞毒性或记忆基因。e 小鼠类器官与CD8⁺T细胞共培养系统的构建。f 柱状图显示SRSF1抑制剂TN2008在HCC类器官与CD8⁺T细胞共培养中的最高抑制率。g,h SRSF1抑制剂TN2008在PDX小鼠模型中抑制肿瘤生长。i SRSF1与TN2008结合的结构复合物概述。j 体外IC50评估TN2008对SRSF1介导的肿瘤生长抑制作用(n=3)。k SPR实验显示重组SRSF1蛋白与TN2008的特异性结合。l 通过分子动力学模拟构建的SRSF1与TN2008结合的同源模型。m 通过MD模拟和MM/PBSA分析确定的关键氨基酸残基及其能量贡献。n 表面等离子体共振(SPR)分析显示TN2008与突变型SRSF1蛋白的相互作用。o qPCR显示SRSF1突变残基对肿瘤细胞糖酵解基因表达的影响。p Western blot显示TN2008降低肿瘤细胞糖酵解基因表达。q Western blot显示TN2008上调小鼠CD8⁺T细胞中的Foxo1表达。r 集落形成实验显示TN2008显著抑制体外肿瘤细胞生长。
在B16F10黑色素瘤(抗PD-1耐药模型)中,TN2008联合抗PD-1治疗使肿瘤体积减少72%,效应型CD8⁺T细胞(CD69⁺CD8⁺)比例增加3.2倍,Tregs/MDSCs比例分别下降40%/35%。CyTOF分析显示,联合治疗组Ki67⁺CD38⁺CD8⁺T细胞比例提升至单药组的2.5倍,肿瘤微环境免疫抑制指数降低55%(图6m-o)。
图6 SRSF1抑制剂TN2008增强T细胞浸润和功能并与抗PD-1治疗协同作用a TN2008在Il2rg−/−NOD-Scid小鼠皮下肿瘤中的抑制作用。b,c TN2008与PD-1阻断在皮下肿瘤模型中的协同作用。d TN2008对HCC模型小鼠肝功能的影响(血清ALT/AST水平)。e 两组小鼠(免疫缺陷 vs 免疫competent)的肿瘤体积减少百分比比较。f TN2008与PD-1 阻断在自发性HCC小鼠模型中的协同作用。g 四组小鼠的肝肿瘤负荷比较。h 四组小鼠的Kaplan-Meier生存分析。i 四组小鼠的肝/体重比比较。j 四组小鼠中效应CD8⁺T细胞比例比较。k 四组小鼠中其他免疫细胞(如Tregs、MDSCs)比例比较。l 四组小鼠中调节性T细胞(Tregs)与效应CD8⁺T细胞比例的比值。m CyTOF分析三组小鼠肿瘤微环境中的T细胞特征。n,o 不同组中CD38⁺CD8⁺T细胞(n)和CD69⁺CD8⁺T细胞(o)的比例比较。p PD-1响应与无响应HCC病例中SRSF1的表达比较。q,r 公共数据库中黑色素瘤(q)和基底细胞癌(r)响应与无响应病例的SRSF1表达。
总结
本研究首次揭示了SRSF1在肿瘤免疫中的“双重反派”角色:在CD8⁺T细胞中抑制代谢和效应功能,在肿瘤细胞中驱动糖酵解代谢重编程,形成免疫逃逸的“双向屏障”。通过基因敲除和小分子抑制剂TN2008的双重验证,证实了靶向SRSF1可同时增强T细胞功能和解除肿瘤代谢抑制,为“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”提供了机制依据。
研究的独特价值在于突破了传统单一靶点的局限,提出“代谢-免疫”双重调控策略,且TN2008在耐药模型中的显著效果为临床转化提供了潜在候选药物。尽管SRSF1在正常组织中的作用仍需进一步验证,但其在多种实体瘤中的高表达特性,预示了该靶点在免疫联合治疗中的广泛应用前景,有望为肝癌、黑色素瘤等难治性肿瘤的治疗带来新选择。
参考文献
Zhu G Q, Tang Z, Chu T H, et al. Targeting SRSF1 improves cancer immunotherapy by dually acting on CD8+ T and tumor cells[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2025, 10(1): 25.
导语:肝细胞癌(HCC)作为全球癌症相关死亡的第四大病因,其治疗困境尤为突出——即便采用手术切除,患者术后复发率仍居高不下,而免疫检查点阻断(ICB)疗法虽带来希望,却仅能使少数患者获益。这一现状的核心挑战在于肿瘤微环境(TME)对CD8⁺T细胞功能的抑制,以及肿瘤细胞通过代谢重编程逃避免疫监视。例如,TME中的葡萄糖剥夺和缺氧会导致CD8⁺T细胞代谢效率低下、功能耗竭,而肿瘤细胞的异常糖酵解又进一步加剧了这一恶性循环。
在这一背景下,RNA结合蛋白SRSF1的潜在作用逐渐浮出水面。已有研究表明,SRSF1在多种肿瘤中高表达,通过调控基因剪接促进肿瘤进展,但其在肿瘤微环境中对CD8⁺T细胞功能的影响却鲜少被探索。2025年1月,Signal Transduction and Targeted Therapy发表了一篇题为“Targeting SRSF1 improves cancer immunotherapy by dually acting on CD8⁺ T and tumor cells”的文章,首次揭示了SRSF1在肿瘤细胞和CD8⁺T细胞中的双重调控机制,为突破免疫治疗瓶颈提供了新视角。
多维度实验揭示双重机制新型抑制剂验证治疗潜力
本研究是一项基础与转化结合的实验研究,旨在通过体内外模型阐明SRSF1对肿瘤免疫的双重作用,并开发靶向药物。研究者首先通过临床样本和公共数据库分析发现,SRSF1表达与CD8⁺T细胞耗竭标志物呈正相关,且在ICB治疗无响应的肿瘤中显著升高。随后构建SRSF1条件性敲除小鼠(Srsf1fl/flCd4-Cre),特异性删除CD4⁺/CD8⁺T细胞中的SRSF1,观察其对肿瘤生长和T细胞功能的影响。同时,利用shRNA敲低肿瘤细胞中的SRSF1,结合转录组、代谢组学分析其对糖酵解通路的调控。
为验证靶向药物潜力,研究者通过虚拟筛选和体外实验开发了小分子抑制剂TN2008,并在HCC和黑色素瘤小鼠模型中评估其单药及联合抗PD-1治疗的效果。主要评价指标包括肿瘤体积变化、CD8⁺T细胞浸润及功能表型(如CD38⁺、IFN-γ⁺细胞比例)、糖酵解代谢物水平(如乳酸、葡萄糖摄取)等,次要指标涉及TME中调节性T细胞(Tregs)和髓源性抑制细胞(MDSCs)的比例变化。
双重机制突破代谢屏障联合治疗逆转免疫耐药
RSF1高表达与CD8⁺T细胞耗竭及免疫治疗无响应密切相关
通过分析TCGA和GTEx数据库,研究者发现SRSF1mRNA在31种肿瘤中的15种显著上调。ESTIMATE算法显示,SRSF1表达与耗竭型CD8⁺T细胞(如LAYN⁺细胞)呈正相关,与细胞毒性/记忆性T细胞呈负相关,且与T细胞耗竭特征基因(如PD-1、CTLA-4)表达显著正相关。在结直肠癌(CRC)和肾细胞癌(RCC)的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据中,肿瘤内CD8⁺T细胞的SRSF1表达显著高于癌旁组织。
进一步对7例人类HCC样本和5例小鼠HCC模型的scRNA-seq分析显示,肿瘤内耗竭型CD8⁺T细胞(TIGIT⁺表型)的SRSF1蛋白和mRNA水平均显著高于效应型CD8⁺T细胞(图1b-f)。在抗PD-1治疗无响应的HCC患者中,肿瘤内CD8⁺T细胞的SRSF1表达显著升高(图1m),基底细胞癌数据库亦验证了这一趋势。
图1 SRSF1水平与CD8⁺T细胞耗竭表型相关a 单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析流程示意图。b 人类CD8⁺T细胞各簇的UMAP可视化:簇0、1、6为naive CD8⁺T细胞;簇2为效应CD8⁺T细胞;簇3、4、5为耗竭CD8⁺T细胞。c 点图显示各细胞簇中SRSF1及T细胞标记基因的表达水平。d 散点图显示细胞毒性与耗竭CD8⁺T细胞之间的差异表达基因(DEGs)。e 小鼠CD8⁺T细胞簇的UMAP图:簇0为耗竭CD8⁺T细胞;簇1、2、3、4、6为naiveCD8⁺T细胞;簇5为效应CD8⁺T细胞。f 点图显示不同细胞簇的标记基因。g 肿瘤及正常组织中耗竭CD8⁺T细胞的SRSF1表达。h Western blot显示耗竭CD8⁺T细胞中的SRSF1表达高于活化CD8⁺T细胞。i 接受新辅助抗PD-1治疗的HCC患者scRNA-seq分析流程示意图。j 人类CD8⁺T细胞各簇的UMAP可视化。k UMAP图显示抗PD-1无响应组与响应组之间的簇差异。l 柱状图显示抗PD-1无响应组与响应组中不同CD8⁺T细胞簇的比例。m 无响应组与响应组中耗竭CD8⁺T细胞的SRSF1表达比较。
CD8⁺T细胞缺失SRSF1可增强其效应功能及过继治疗效果
构建Srsf1条件性敲除小鼠(Srsf1fl/flCd4-Cre)后,CD8⁺T细胞中SRSF1蛋白完全缺失(图2a)。在CTNNB1;Trp53诱导的HCC模型中,敲除组小鼠的肿瘤体积较对照组减少45%,肝/体重比降低32%,生存期延长35%(图2c-e)。scRNA-seq显示,敲除组肿瘤内效应型CD8⁺T细胞(CD44⁺CD62L⁻)比例增加2.3倍,CD38⁺CD8⁺T细胞(活化表型)显著富集(图2f-i),且IFN-γ⁺、GZMB⁺细胞比例提升(图2j)。
过继转移实验中,SRSF1敲除的OT-ICD8⁺T细胞可使Hep1-6-OVA肿瘤生长抑制率达68%,小鼠存活率提升50%。与抗PD-1联合使用时,在Hepa1-6和B16F10模型中,肿瘤体积较单药组再减少30%-40%,CD38⁺CD8⁺T细胞比例增加至对照组的2.8倍(图2k-m)。
图2 CD8⁺T细胞中SRSF1缺失增强其细胞毒性a CD8⁺T细胞中条件性敲除Srsf1的示意图及两组CD8⁺T细胞的SRSF1表达。b,c Srsf1Cd4-Cre 与 Srsf1+/+Cd4-Cre小鼠的HCC进展比较(每组n=6)。d 两组小鼠的肿瘤数量(左)和肝/体重比(右)分析(每组n=6)。e Kaplan-Meier生存分析(每组n=6)。f,g 小鼠HCC组织T细胞的UMAP图:NC为 Srsf1+/+Cd4-Cre组,KO为Srsf1Cd4-Cre组。h 两组小鼠的T细胞亚群比例分析(每组n=3)。i scRNA-seq数据显示CD38在两组小鼠中的表达及分布差异。j UMAP图中GZMK的表达(来自scRNA-seq分析)。k HCC或B16F10肿瘤模型联合PD-1治疗的示意图(Hep1-6或B16F10细胞:2×10⁵)及CD8⁺T细胞中SRSF1敲除与PD-1治疗的协同作用。l,m 流式细胞术显示Srsf1fl/flCd4-Cre小鼠肿瘤中CD38⁺CD8⁺T细胞(l)和效应CD8⁺T细胞(CD44⁺CD62LlowCD8⁺,m)比例显著高于对照组。
RSF1通过调控FOXO1和mTOR通路增强CD8⁺T细胞糖酵解代谢
RNA测序显示,SRSF1敲除的CD8⁺T细胞中,糖酵解相关基因(如HK2、PFKP)和mTOR通路基因(如AKT、S6)显著上调(图3b-e)。Westernblot证实,敲除组PTEN蛋白减少40%,磷酸化S6(pS6)增加60%,提示mTORC1通路激活(图3g)。抑制mTOR(雷帕霉素处理)可逆转糖酵解增强和IFN-γ分泌(图3h,i)。
机制上,SRSF1通过RRM1结构域结合PTEN的3'UTR,敲除后PTENmRNA稳定性下降55%(图3j)。转录因子分析显示,FOXO1是CD38上调的关键调控因子——敲除SRSF1可使FOXO1蛋白增加70%,而敲低FOXO1则完全逆转CD38表达(图3k-m)。进一步发现,SRSF1通过结合NLK的3'UTR稳定其mRNA,敲除后NLK蛋白减少50%,解除对FOXO1的核输出抑制(图3o-p)。
图3 CD8⁺T细胞中SRSF1缺失通过调控FOXO1增加CD38表达a Srsf1+/+CD8⁺T细胞与Srsf1−/−CD8⁺T细胞的DEGs热图(上调/下调基因)。b CD8⁺T细胞的KEGG分析(Srsf1+/+CD8⁺T vs Srsf1−/−CD8⁺T)。c-e CD8⁺T细胞的基因簇分析(Srsf1+/+CD8⁺T vs Srsf1−/−CD8⁺T)。f qPCR分析 Srsf1+/+CD8⁺T细胞与Srsf1−/−CD8⁺T细胞的细胞毒性基因表达。g Western blot显示Srsf1−/−CD8⁺T细胞与Srsf1+/+CD8⁺T细胞中PTEN和S6的表达。h 雷帕霉素处理对Srsf1−/−CD8⁺T细胞效应表型比例的影响。i Seahorse实验显示CD8⁺T细胞缺失Srsf1可增加糖酵解代谢,且可被mTOR抑制剂逆转。j 荧光素酶分析显示SRSF1-RRM1结合PTEN mRNA的3'UTR。k SRSF1-KO CD8⁺T细胞中上调的转录因子(TF)与mTOR通路相关TF的交集结果(KO:敲除)。l scRNA-seq分析中FOXO1的UMAP表达图。m Western blot显示Foxo1沉默后CD38和Foxo1蛋白水平在Srsf1+/+和Srsf1−/−CD8⁺T细胞中的变化。n ChIP实验显示Foxo1在转录水平上调Cd38。o Western blot显示Srsf1−/−CD8⁺T细胞中Nlk表达下调。p 荧光素酶分析显示SRSF1-RRM1结合Nlk mRNA的3'UTR。q 对照组与Srsf1+/-CD8⁺T细胞中Nlk、Foxo1和Pten的mRNA表达比较。
肿瘤细胞缺失SRSF1可抑制糖酵解并解除对CD8⁺T细胞的代谢抑制 在Hep1-6-OVA细胞中敲低SRSF1(shSRSF1),糖酵解能力(Seahorse检测)下降42%,葡萄糖摄取(18F-FDG)减少35%,乳酸生成降低51%。代谢组学显示,糖酵解中间产物(如PGK1、PGAM1)水平显著下调。转录因子分析发现,SRSF1通过RRM1结合c-Myc、c-Jun、JunB的3'UTR,敲低后三者mRNA稳定性下降60%-70%,蛋白水平减少50%-65%(图4g-i)。
图4 肿瘤内源性SRSF1缺失通过下调bZIP转录因子和c-Myc抑制糖酵解a SRSF1下调基因的KEGG分析。b SRSF1调控的可变剪接事件(AS events)的KEGG分析。c,d Western blot和qPCR显示SRSF1调控糖酵解基因。e,f SRSF1-RIP-seq峰在5'UTR、CDS和内含子区域的富集情况(根据基因组元件分布分类并与基因组背景比较)。g RIP实验显示SRSF1结合c-Myc、c-Jun和JunB。h,i PCR和Western blot显示SRSF1调控c-Myc、c-Jun和JunB转录因子。j SRSF1及其结构域缺失突变体(ΔRRM1、ΔRRM2、ΔRS)的示意图。k Western blot分析SRSF1-sh细胞中转染内源性/外源性SRSF1(HA标记)的转录因子表达(突变体包括ΔRRM1、ΔRRM2、ΔRS)。l-n SRSF1通过结合mRNA的3'UTR保护c-Myc、c-Jun和JunB转录因子(ActD处理后mRNA稳定性分析)。
共培养实验中,shSRSF1肿瘤细胞与OT-ICD8⁺T细胞共孵育8小时后,T细胞中IFN-γ⁺、GZMB⁺细胞比例增加至对照组的2.1倍,细胞毒性(台盼蓝染色)提升48%。在免疫缺陷小鼠中,shSRSF1肿瘤生长抑制率仅为22%,而在野生型小鼠中达58%,提示T细胞依赖性抗肿瘤效应。
小分子抑制剂TN2008靶向SRSF1可协同抗PD-1治疗逆转免疫耐药
通过虚拟筛选和体外验证,开发出SRSF1抑制剂TN2008(IC50=144μM),其与SRSF1的RRM1结构域结合能为-5.1kcal/mol,特异性结合野生型SRSF1(Kd=5.13×10⁻⁶M),对突变型(GLU44/PRO48等位点突变)结合力下降7倍(图5i-n)。在HCC类器官与CD8⁺T细胞共培养模型中,TN2008使肿瘤生长抑制率达65%(图5e-f)。
图5 SRSF1抑制剂TN2008的鉴定a SRSF1抑制剂筛选流程示意图。b 体外增殖实验筛选出的前10名SRSF1抑制剂候选化合物。c SRSF1抑制剂作用于CD8⁺T细胞的示意图。d 热图显示SRSF1抑制剂上调CD8⁺T细胞的细胞毒性或记忆基因。e 小鼠类器官与CD8⁺T细胞共培养系统的构建。f 柱状图显示SRSF1抑制剂TN2008在HCC类器官与CD8⁺T细胞共培养中的最高抑制率。g,h SRSF1抑制剂TN2008在PDX小鼠模型中抑制肿瘤生长。i SRSF1与TN2008结合的结构复合物概述。j 体外IC50评估TN2008对SRSF1介导的肿瘤生长抑制作用(n=3)。k SPR实验显示重组SRSF1蛋白与TN2008的特异性结合。l 通过分子动力学模拟构建的SRSF1与TN2008结合的同源模型。m 通过MD模拟和MM/PBSA分析确定的关键氨基酸残基及其能量贡献。n 表面等离子体共振(SPR)分析显示TN2008与突变型SRSF1蛋白的相互作用。o qPCR显示SRSF1突变残基对肿瘤细胞糖酵解基因表达的影响。p Western blot显示TN2008降低肿瘤细胞糖酵解基因表达。q Western blot显示TN2008上调小鼠CD8⁺T细胞中的Foxo1表达。r 集落形成实验显示TN2008显著抑制体外肿瘤细胞生长。
在B16F10黑色素瘤(抗PD-1耐药模型)中,TN2008联合抗PD-1治疗使肿瘤体积减少72%,效应型CD8⁺T细胞(CD69⁺CD8⁺)比例增加3.2倍,Tregs/MDSCs比例分别下降40%/35%。CyTOF分析显示,联合治疗组Ki67⁺CD38⁺CD8⁺T细胞比例提升至单药组的2.5倍,肿瘤微环境免疫抑制指数降低55%(图6m-o)。
图6 SRSF1抑制剂TN2008增强T细胞浸润和功能并与抗PD-1治疗协同作用a TN2008在Il2rg−/−NOD-Scid小鼠皮下肿瘤中的抑制作用。b,c TN2008与PD-1阻断在皮下肿瘤模型中的协同作用。d TN2008对HCC模型小鼠肝功能的影响(血清ALT/AST水平)。e 两组小鼠(免疫缺陷 vs 免疫competent)的肿瘤体积减少百分比比较。f TN2008与PD-1 阻断在自发性HCC小鼠模型中的协同作用。g 四组小鼠的肝肿瘤负荷比较。h 四组小鼠的Kaplan-Meier生存分析。i 四组小鼠的肝/体重比比较。j 四组小鼠中效应CD8⁺T细胞比例比较。k 四组小鼠中其他免疫细胞(如Tregs、MDSCs)比例比较。l 四组小鼠中调节性T细胞(Tregs)与效应CD8⁺T细胞比例的比值。m CyTOF分析三组小鼠肿瘤微环境中的T细胞特征。n,o 不同组中CD38⁺CD8⁺T细胞(n)和CD69⁺CD8⁺T细胞(o)的比例比较。p PD-1响应与无响应HCC病例中SRSF1的表达比较。q,r 公共数据库中黑色素瘤(q)和基底细胞癌(r)响应与无响应病例的SRSF1表达。
总结
本研究首次揭示了SRSF1在肿瘤免疫中的“双重反派”角色:在CD8⁺T细胞中抑制代谢和效应功能,在肿瘤细胞中驱动糖酵解代谢重编程,形成免疫逃逸的“双向屏障”。通过基因敲除和小分子抑制剂TN2008的双重验证,证实了靶向SRSF1可同时增强T细胞功能和解除肿瘤代谢抑制,为“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”提供了机制依据。
研究的独特价值在于突破了传统单一靶点的局限,提出“代谢-免疫”双重调控策略,且TN2008在耐药模型中的显著效果为临床转化提供了潜在候选药物。尽管SRSF1在正常组织中的作用仍需进一步验证,但其在多种实体瘤中的高表达特性,预示了该靶点在免疫联合治疗中的广泛应用前景,有望为肝癌、黑色素瘤等难治性肿瘤的治疗带来新选择。
参考文献
Zhu G Q, Tang Z, Chu T H, et al. Targeting SRSF1 improves cancer immunotherapy by dually acting on CD8+ T and tumor cells[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2025, 10(1): 25.