导语：肿瘤微环境(TME)中 T 细胞活性的精准调控是抗肿瘤免疫的核心环节，但构建 T 细胞功能 niche 的成纤维细胞类型、分化路径及作用机制长期未明。既往研究发现，三级淋巴结构(TLS)和 T 细胞轨道(TT)等免疫聚集区与肺癌患者预后正相关，但其结构基础 —— 成纤维细胞的异质性及功能分工尚不清晰。2025 年 1 月，Cell杂志发表了一篇题为“Fibroblastic reticular cells generate protective intratumoral T cell environments in lung cancer”的文章，聚焦成纤维网状细胞(FRCs)在肺癌中的作用，发现其通过构建互联 T 细胞微环境(TEs)促进抗肿瘤免疫，为解析 TME 调控机制提供了新视角。

多组学联合空间定位，揭秘 FRCs 分化与免疫互作网络

本研究是一项结合临床样本与动物模型的转化医学研究，旨在阐明 FRCs 在肺癌 TME 中的生物学功能及调控网络。研究者首先收集 7 例非小细胞肺癌(NSCLC)患者的癌组织、癌旁及远端肺组织，通过免疫组化、单细胞 RNA 测序(scRNA-seq)和空间转录组技术，解析 FRCs 的表型异质性及空间分布。在小鼠 Lewis 肺癌模型中，利用 Ccl19-Cre 谱系追踪、细胞命运图谱和功能缺失实验(如白喉毒素消融 FRC 前体细胞)，验证 FRCs 对T 细胞功能的调控作用。通过 CellChat 算法构建FRC-T 细胞互作网络，并结合病毒载体免疫治疗模型，评估 FRCs 对免疫治疗响应的影响。主要评价指标包括 FRC 亚群分化轨迹、T 细胞浸润密度、效应分子表达及肿瘤生长动力学。

FRCs 通过双谱系分化构建多层级 T 细胞微环境，分子互作网络驱动抗肿瘤免疫应答

FRC 亚群的表型异质性与空间定位特征

在 NSCLC 组织中，CCL19+ FRCs 呈现双亚群分化特征。血管周围网状细胞(PRCs)高表达血管周细胞标记 MCAM、NOTCH3 及收缩蛋白ACTA2，定位于 CD31 + 血管周围微环境(图 1H、4F)，占肿瘤边缘成纤维细胞的 18.7%±3.2%。其转录特征与淋巴结血管周围网状细胞(SLO-PRCs)高度相似(图 1M)，通过分泌 CCL19/CCL21 形成浓度梯度(图 2H，p<0.001)，引导CD8+ T 细胞向肿瘤中心迁移。T 细胞区网状细胞(TRCs)则富集 POSTN(骨膜蛋白)、PDPN(足突蛋白)及 ICAM1，形成三维网状结构支撑 TLS 内 T 细胞区(图 1G、3A)，占肿瘤边缘成纤维细胞的 22.4%±4.1%，其转录谱与淋巴结 T 细胞区网状细胞(SLO-TRCs)匹配(图 1N)，并通过 SULF1(硫酸酯酶 1)修饰细胞外基质，促进 T 细胞与树突状细胞的相互作用(图 3C)。

图 1. 非小细胞肺癌中表达 CCL19 的成纤维网状细胞亚群

(A)计算机断层扫描图像显示 NSCLC 患者(NSCLC2)的胸部，肿瘤(黄线)位于右下肺叶。虚线表示下方照片中横截面的大致位置。(B)NSCLC 组织切片(SM 和 CM 区域)的免疫组化染色图像。(C)SM 和 CM 中 T 细胞和 B 细胞簇的定量分析(n=7)。数据表示为平均值 ± 标准差，配对 Student’s t 检验。(D)CM 区域 TLS 中的 T 细胞图像，为(B)中方框区域的高倍放大。右图为同一 TLS 的连续切片，用抗 ACTA2 抗体染色。(G)TLS 中 T 细胞区的最大强度投影共聚焦图像，箭头示与 T 细胞相互作用的 CCL19 + 细胞。(H)TLS 中血管周围微环境的共聚焦图像，箭头示 CCL19+ CCL21 + 细胞。(I)CM 区域血管周围微环境的共聚焦图像，箭头头示与 CD3+ T 细胞相互作用的 CCL19+ CCL21 + 细胞。(J)SM 区域 T 细胞轨道的共聚焦图像，箭头头示与 T 细胞相互作用的 CCL19 + 细胞。(K)来自 CM、SM(CAF1/PRC 和 CAF2/TRC)和未受影响肺组织(LU，SMC/PC 和 AdvFB)的 CCL19 + 成纤维细胞的单细胞 RNA 测序(scRNA-seq)结果的 UMAP(均匀流形近似与投影)表示。(L)点图显示指定亚群中普通成纤维细胞和 FRC 基因的平均表达。

从空间分布来看，在肿瘤 - 肺交界区(CM)，PRCs 与 TRCs 通过血管周微环境与 TLS 的物理连接形成 “免疫走廊”。CCL19 荧光强度在 T 细胞轨道(TT)中呈极性分布(图 2D-F，p<0.001)，提示其具有引导 T 细胞从 TLS 向肿瘤实质迁移的功能(图 2C)。

图 2. 非小细胞肺癌中互联 T 细胞微环境的拓扑结构

(A)T 细胞微环境大规模显微镜分析的实验流程。(B)NSCLC 组织在指定距离的完整切片。(C)NSCLC 中互联的 T 细胞微环境。同一肿瘤的连续切片用指定抗体染色。(D)NSCLC 边缘 T 细胞轨道的共聚焦显微镜图像。(E)(D)中 T 细胞轨道 1 的 CCL19 荧光强度测量。(F)(D)中 T 细胞轨道 1-5 的 CCL19 荧光强度直方图。(G)NSCLC肿瘤内血管周围微环境的共聚焦图像。(H)血管周围微环境的荧光强度直方图(见图 S3D)。

FRCs 起源于血管周与外膜成纤维细胞双谱系分化

单细胞轨迹分析显示，FRCs 分化遵循两条独立路径。PRC 谱系(T1 轨迹)起源于表达DES(结蛋白)的血管壁平滑肌细胞 / 周细胞(SMC/PC)，经 MYH11 + 中间态分化为 RGS5+ NOTCH3+ PRCs(图 4C-E)。在小鼠 LLC-gp33 肿瘤中，Ccl19-EYFP+ DES + 细胞定位于血管周围，与 CD8+ T 细胞直接接触(图 4D、5H)。TRC 谱系(T2 轨迹)则由表达 CLU(丛生蛋白)的外膜成纤维细胞(AdvFBs)启动，通过 LEPR+ CD34 + 祖细胞分化为 POSTN+ TRCs(图 4I-K)。在免疫治疗模型中，AdvFBs 经病毒载体诱导可分化为 TLS TRCs(T3 轨迹)，高表达 IL33 及趋化因子 CXCL12(图 6H)，促进 T 细胞干细胞样表型(TCF7+)维持(图 3K)。

图 3. 非小细胞肺癌中成纤维网状细胞与 T 细胞的相互作用

(A)CM 区域TLS 的共聚焦显微镜图像。方框区域为高倍放大区域，左下为 TRC 网络，右下为单个 TRC。(B)CM 区域血管周围微环境的共聚焦图像。(C)SM 区域肿瘤内 T 细胞轨道的共聚焦图像。箭头头示相互作用的细胞。(D)CD8+ T 细胞的单细胞 RNA 测序结果的 UMAP 表示，从总免疫细胞分析中重新嵌入。(E)散点图显示所有检测到的信号通路中单个细胞亚群的相互作用强度。(F)点图描绘不同细胞亚群之间单个信号通路的输入和输出通信模式。(J)成纤维细胞亚群中指定受体下游激活基因的平均表达热图。(K)NSCLC 的 CM 区域 T 细胞轨道的共聚焦图像。(L)SM 区域 T 细胞轨道的共聚焦图像。箭头头和线条示单个 KI67 + 细胞，下方为高倍放大显微图。

体内验证方面，在 Ccl19-iEYFP 小鼠中，命运标记的 FRCs 在肿瘤内形成单克隆细胞簇(图 5Q)，证实其通过克隆性增殖扩大免疫微环境，且 PRCs 与 TRCs 分别起源于SMC/PC 和 AdvFBs(图 5N-P)。

图 4. 非小细胞肺癌中成纤维网状细胞的分化轨迹

(A)使用 Monocle3 算法计算的分化轨迹 T1(a 和 b)和 T2 的 UMAP 表示，投影于CCL19 + 成纤维细胞亚群。(B)UMAP 描绘投影于 CCL19 + 成纤维细胞亚群的伪时间。(C)特征 UMAP 显示沿轨迹 T1 表达的基因。(D)NSCLC 的 CM 区域 TLS 的共聚焦图像。(E)特征UMAP 显示沿轨迹 T1 表达的指定基因。(F)NSCLC 的 CM 区域 TLS 和血管周围微环境的共聚焦图像。(G)沿子轨迹 T1b 表达的基因的特征UMAP 表示。(H)NSCLC 的 CM 区域 TLS 的共聚焦图像。(I)沿子轨迹 T2 表达的基因的特征 UMAP 表示。(J)CM 外膜区域的共聚焦图像。(K)(J)中所示 TLS 的共聚焦图像，方框区域为右侧高倍放大图像。(L)NSCLC 中表达 CCL19 的成纤维细胞分化轨迹示意图。

FRC-T 细胞互作网络调控 T 细胞活化与分化

通过 CellChat 算法解析，FRCs与 CD8+ T 细胞存在 3 类关键互作。在迁移引导方面，PRCs 通过 CXCL12-CXCR4 轴(配体 - 受体对表达率 68%)及VCAM1-ITGA4(59%)促进 T 细胞黏附于血管壁，TRCs 则通过 CCL19-CCR7 轴(72%)引导 T 细胞向 TLS 聚集(图 3G、S3D)。在活化维持方面，TRCs表达 LTBR 配体(LTA/LTB)及 IFN-γ 响应基因(如 IDO1)，通过 TNFRSF14 信号维持 CD8+ T 细胞效应表型(GZMB + 细胞比例：FRC 完整组45.2% vs. 消融组 21.7%，p<0.001，图 7L)。在干性保护方面，在 TLS 中，TRCs 与 TCF7 +干细胞样 T 细胞形成膜接触(图 3K)，通过 NOTCH3-Jagged1 通路抑制 T 细胞耗竭(PD1 + 细胞比例：FRC 完整组28.5% vs. 消融组 52.1%，p<0.001，图 7N)。

图 5. 小鼠肺肿瘤中表达 Ccl19 的成纤维网状细胞亚群

(A)实验方法示意图。(B)Ccl19-EYFP 小鼠胸膜下区域表达 TOMATO(TOM+)的 LLC-gp33 肿瘤的共聚焦图像。(C 和 D)LLC-gp33 肿瘤中血管周围微环境(C)和 T 细胞轨道(D)的共聚焦图像。(E)从未受影响肺组织和第 23 天切除的LLC-gp33 肿瘤中 sort 的 Ccl19-EYFP + 细胞的 scRNA-seq 分析的 UMAP 表示。(F)点图显示成纤维细胞和 FRC 相关基因的平均表达。(G 和 H)第 23 天 LLC-gp33 肿瘤中 T 细胞轨道(G)和血管周围微环境(H)的共聚焦图像。(I)第 15 天 Ccl19-EYFP 小鼠胸膜下区域 LLC-gp33 肿瘤病变(TOM+)的共聚焦图像。(J)第 15 天 LLC-gp33 肿瘤病变中 EYFP + 成纤维细胞和 CD8+ T 细胞的共聚焦图像。(K)从未受影响肺组织、肿瘤细胞注射后第 15 天肺组织(红色细胞)和第 23 天切除的 LLC-gp33 肿瘤中 sort 的 Ccl19-EYFP + 细胞的 UMAP 表示。(L)基于Slingshot 算法推断的分化轨迹 T1 和 T2 的 UMAP 表示。(M)通过向可诱导的Ccl19-iEYFP 和 Ccl19-iBbw 小鼠注射LLC-gp33 细胞并在肿瘤细胞注射后第 15 天用多西环素处理，进行 FRC 命运 mapping 实验。(N)如(L)中的 Ccl19-EYFP + 细胞的 UMAP 表示，并投影从多西环素处理的 LLC-gp33 肿瘤中 sort 的 Ccl19-iEYFP + 细胞(红色，fm：命运标记细胞)。(O 和 P)多西环素处理的 Ccl19-iEYFP 小鼠第 23 天 LLC-gp33 肿瘤中 T 细胞轨道(O)和血管周围微环境(P)的共聚焦图像。(Q)多西环素处理的 Ccl19-iBbw 小鼠第 23 天 LLC-gp33 肿瘤的共聚焦图像。

FRCs 缺失导致抗肿瘤免疫功能衰竭

在 Ccl19-EYFP/DTR 小鼠中，白喉毒素消融 FRC 前体细胞后，多项指标显示抗肿瘤免疫功能受损。T 细胞浸润显著减少，肿瘤内 CD8+ T 细胞密度下降 62%(p<0.001，图 7B)，TLS 形成失败，T 细胞轨道数量减少81%(图 S6C)。效应功能方面，肿瘤特异性 CD8+ T 细胞(gp33 tetramer+)中，IFNγ+ 细胞比例从 38.7% 降至 12.1%(p<0.001，图 7K)，颗粒酶B(GZMB)表达量降低 59%(图 7L)。肿瘤进展方面，肺肿瘤重量增加 58%(p=0.0012，图 7D)，转移结节数量增加 73%(p=0.0001，图 7E)，提示 FRCs 是维持抗肿瘤免疫的必要条件。

图 6. 冠状病毒载体免疫治疗中表达 Ccl19 的成纤维网状细胞亚群

(A)实验方法示意图。(B)mCOV-Flt3l-gp33 免疫后第 23 天 LLC-gp33 肿瘤(TOMATO+)的共聚焦图像。(C)免疫后 LLC-gp33 肿瘤边缘区域的共聚焦图像。(D)免疫后第 23 天 LLC-gp33肿瘤边缘 TLS 的共聚焦图像。(E)多维标度(MDS)图显示 mCOV-Flt3l-gp33 载体免疫小鼠肿瘤中 Ccl19-EYFP + 成纤维细胞亚群(三角形)与未免疫小鼠肿瘤和肺细胞(十字)的转录相似性。(F)点图显示 mCOV-Flt3l-gp33 载体免疫小鼠(第 23 天)LLC-gp33 肿瘤中Ccl19-EYFP + 成纤维细胞亚群的特征基因平均表达。(G)基于 Slingshot 算法推断的分化轨迹，投影于 mCOV-Flt3l-gp33 载体免疫小鼠 LLC-gp33 肿瘤中 Ccl19-EYFP + 细胞的 scRNA-seq 分析的 UMAP 表示。(H)沿伪时间表达的指定基因，细胞按伪时间排序。(I)命运 mapping 方法示意图。(J)第23 天 TLS 的共聚焦图像，示命运标记的肿瘤 FRCs。

免疫治疗通过诱导 FRCs 增强 T 细胞应答

在 mCOV-Flt3l-gp33 病毒载体治疗模型中，出现了 FRCs 相关的积极变化。TLS TRCs 特异性诱导方面，治疗组肿瘤边缘出现 CLU+ TLS TRCs 亚群，其 CXCL12 表达量较未治疗组高 2.3 倍(p<0.01，图 6F)，与 B 细胞区形成紧密互作。T细胞增殖方面，Ki67+ cycling CD8+ T 细胞比例从 15.3% 升至 32.7%(p<0.001，图 3L)，EdU 掺入率提高 28%，表明 FRCs 促进 T 细胞克隆扩张。治疗效果方面，在 FRCs 完整小鼠中，病毒治疗使肿瘤体积缩小 41%，而 FRCs 消融组无显著变化(图 7B)，证实 FRCs 是免疫治疗起效的关键基质基础。

图 7. 表达 Ccl19 的成纤维网状细胞控制抗肿瘤 T 细胞应答

(A)实验方法示意图。(B)mCOV-Flt3l-gp33 处理的 LLC-gp33 肿瘤第 23 天的共聚焦图像。(C)通过四聚体染色和流式细胞术分析 GP33/34+ CD8+ T 细胞(n≥7，3 次独立实验)。(D)计算荷瘤肺的净肿瘤重量(减去未受影响肺的平均重量)(n≥7，3 次独立实验)。数据表示为平均值 ± 标准差。(E)显微镜检查评估指定小鼠左肺叶的肿瘤结节数量(n≥7，3 次独立实验)。(F)mCOV-Flt3l-gp33 免疫后第 23 天，从 DTR - 和 DTR + 肺中sort 的 gp33/34 四聚体 + CD8+ T 细胞的 scRNA-seq 分析的 UMAP 表示。 (G 和 H)基于 DTR - 肺与 DTR + 肺效应 CD8+ T 细胞中差异表达基因，DTR + 肺中耗竭(G)和增殖(H)CD8+ T 细胞富集的基因集。(I)实验方法示意图。(J)流式细胞术计数 DTR - 和DTR + 肺中 CD8+ CD45.1+ P14 细胞(n=8)。数据表示为平均值 ± 标准差。(K)流式细胞术测定P14 细胞中 IFNG + 和 TNF

总结

本研究系统揭示了肺癌中 FRCs 的双重角色 —— 作为结构组织者构建互联 T 细胞微环境，作为免疫调控者驱动 T 细胞活化与分化。通过临床样本多组学分析与小鼠功能验证，首次明确 PRCs/TRCs的血管周 / 间质分化路径及其对 T 细胞干性、效应功能的分级调控机制。研究发现，FRCs 缺失导致 T 细胞耗竭与免疫治疗抵抗，而诱导 FRCs 向 TRCs 极化可增强抗肿瘤免疫应答。这些发现不仅填补了 TME 中成纤维细胞功能研究的空白，更为靶向调控肿瘤免疫微环境提供了新方向 —— 通过干预 FRCs 分化路径(如激活 NOTCH3 或阻断 TGFβ 信号)或增强 CCL19-CCR7 轴功能，有望开发新型免疫联合疗法，改善肺癌患者预后。

参考文献

Onder L, Papadopoulou C, Lütge A, et al. Fibroblastic reticular cells generate protective intratumoral T cell environments in lung cancer[J]. Cell, 2025, 188(2): 430-446. e20.

导语：肿瘤微环境(TME)中 T 细胞活性的精准调控是抗肿瘤免疫的核心环节，但构建 T 细胞功能 niche 的成纤维细胞类型、分化路径及作用机制长期未明。既往研究发现，三级淋巴结构(TLS)和 T 细胞轨道(TT)等免疫聚集区与肺癌患者预后正相关，但其结构基础 —— 成纤维细胞的异质性及功能分工尚不清晰。2025 年 1 月，Cell杂志发表了一篇题为“Fibroblastic reticular cells generate protective intratumoral T cell environments in lung cancer”的文章，聚焦成纤维网状细胞(FRCs)在肺癌中的作用，发现其通过构建互联 T 细胞微环境(TEs)促进抗肿瘤免疫，为解析 TME 调控机制提供了新视角。

多组学联合空间定位，揭秘 FRCs 分化与免疫互作网络

本研究是一项结合临床样本与动物模型的转化医学研究，旨在阐明 FRCs 在肺癌 TME 中的生物学功能及调控网络。研究者首先收集 7 例非小细胞肺癌(NSCLC)患者的癌组织、癌旁及远端肺组织，通过免疫组化、单细胞 RNA 测序(scRNA-seq)和空间转录组技术，解析 FRCs 的表型异质性及空间分布。在小鼠 Lewis 肺癌模型中，利用 Ccl19-Cre 谱系追踪、细胞命运图谱和功能缺失实验(如白喉毒素消融 FRC 前体细胞)，验证 FRCs 对T 细胞功能的调控作用。通过 CellChat 算法构建FRC-T 细胞互作网络，并结合病毒载体免疫治疗模型，评估 FRCs 对免疫治疗响应的影响。主要评价指标包括 FRC 亚群分化轨迹、T 细胞浸润密度、效应分子表达及肿瘤生长动力学。

FRCs 通过双谱系分化构建多层级 T 细胞微环境，分子互作网络驱动抗肿瘤免疫应答

FRC 亚群的表型异质性与空间定位特征

在 NSCLC 组织中，CCL19+ FRCs 呈现双亚群分化特征。血管周围网状细胞(PRCs)高表达血管周细胞标记 MCAM、NOTCH3 及收缩蛋白ACTA2，定位于 CD31 + 血管周围微环境(图 1H、4F)，占肿瘤边缘成纤维细胞的 18.7%±3.2%。其转录特征与淋巴结血管周围网状细胞(SLO-PRCs)高度相似(图 1M)，通过分泌 CCL19/CCL21 形成浓度梯度(图 2H，p<0.001)，引导CD8+ T 细胞向肿瘤中心迁移。T 细胞区网状细胞(TRCs)则富集 POSTN(骨膜蛋白)、PDPN(足突蛋白)及 ICAM1，形成三维网状结构支撑 TLS 内 T 细胞区(图 1G、3A)，占肿瘤边缘成纤维细胞的 22.4%±4.1%，其转录谱与淋巴结 T 细胞区网状细胞(SLO-TRCs)匹配(图 1N)，并通过 SULF1(硫酸酯酶 1)修饰细胞外基质，促进 T 细胞与树突状细胞的相互作用(图 3C)。

图 1. 非小细胞肺癌中表达 CCL19 的成纤维网状细胞亚群

(A)计算机断层扫描图像显示 NSCLC 患者(NSCLC2)的胸部，肿瘤(黄线)位于右下肺叶。虚线表示下方照片中横截面的大致位置。(B)NSCLC 组织切片(SM 和 CM 区域)的免疫组化染色图像。(C)SM 和 CM 中 T 细胞和 B 细胞簇的定量分析(n=7)。数据表示为平均值 ± 标准差，配对 Student’s t 检验。(D)CM 区域 TLS 中的 T 细胞图像，为(B)中方框区域的高倍放大。右图为同一 TLS 的连续切片，用抗 ACTA2 抗体染色。(G)TLS 中 T 细胞区的最大强度投影共聚焦图像，箭头示与 T 细胞相互作用的 CCL19 + 细胞。(H)TLS 中血管周围微环境的共聚焦图像，箭头示 CCL19+ CCL21 + 细胞。(I)CM 区域血管周围微环境的共聚焦图像，箭头头示与 CD3+ T 细胞相互作用的 CCL19+ CCL21 + 细胞。(J)SM 区域 T 细胞轨道的共聚焦图像，箭头头示与 T 细胞相互作用的 CCL19 + 细胞。(K)来自 CM、SM(CAF1/PRC 和 CAF2/TRC)和未受影响肺组织(LU，SMC/PC 和 AdvFB)的 CCL19 + 成纤维细胞的单细胞 RNA 测序(scRNA-seq)结果的 UMAP(均匀流形近似与投影)表示。(L)点图显示指定亚群中普通成纤维细胞和 FRC 基因的平均表达。

从空间分布来看，在肿瘤 - 肺交界区(CM)，PRCs 与 TRCs 通过血管周微环境与 TLS 的物理连接形成 “免疫走廊”。CCL19 荧光强度在 T 细胞轨道(TT)中呈极性分布(图 2D-F，p<0.001)，提示其具有引导 T 细胞从 TLS 向肿瘤实质迁移的功能(图 2C)。

图 2. 非小细胞肺癌中互联 T 细胞微环境的拓扑结构

(A)T 细胞微环境大规模显微镜分析的实验流程。(B)NSCLC 组织在指定距离的完整切片。(C)NSCLC 中互联的 T 细胞微环境。同一肿瘤的连续切片用指定抗体染色。(D)NSCLC 边缘 T 细胞轨道的共聚焦显微镜图像。(E)(D)中 T 细胞轨道 1 的 CCL19 荧光强度测量。(F)(D)中 T 细胞轨道 1-5 的 CCL19 荧光强度直方图。(G)NSCLC肿瘤内血管周围微环境的共聚焦图像。(H)血管周围微环境的荧光强度直方图(见图 S3D)。

FRCs 起源于血管周与外膜成纤维细胞双谱系分化

单细胞轨迹分析显示，FRCs 分化遵循两条独立路径。PRC 谱系(T1 轨迹)起源于表达DES(结蛋白)的血管壁平滑肌细胞 / 周细胞(SMC/PC)，经 MYH11 + 中间态分化为 RGS5+ NOTCH3+ PRCs(图 4C-E)。在小鼠 LLC-gp33 肿瘤中，Ccl19-EYFP+ DES + 细胞定位于血管周围，与 CD8+ T 细胞直接接触(图 4D、5H)。TRC 谱系(T2 轨迹)则由表达 CLU(丛生蛋白)的外膜成纤维细胞(AdvFBs)启动，通过 LEPR+ CD34 + 祖细胞分化为 POSTN+ TRCs(图 4I-K)。在免疫治疗模型中，AdvFBs 经病毒载体诱导可分化为 TLS TRCs(T3 轨迹)，高表达 IL33 及趋化因子 CXCL12(图 6H)，促进 T 细胞干细胞样表型(TCF7+)维持(图 3K)。

图 3. 非小细胞肺癌中成纤维网状细胞与 T 细胞的相互作用

(A)CM 区域TLS 的共聚焦显微镜图像。方框区域为高倍放大区域，左下为 TRC 网络，右下为单个 TRC。(B)CM 区域血管周围微环境的共聚焦图像。(C)SM 区域肿瘤内 T 细胞轨道的共聚焦图像。箭头头示相互作用的细胞。(D)CD8+ T 细胞的单细胞 RNA 测序结果的 UMAP 表示，从总免疫细胞分析中重新嵌入。(E)散点图显示所有检测到的信号通路中单个细胞亚群的相互作用强度。(F)点图描绘不同细胞亚群之间单个信号通路的输入和输出通信模式。(J)成纤维细胞亚群中指定受体下游激活基因的平均表达热图。(K)NSCLC 的 CM 区域 T 细胞轨道的共聚焦图像。(L)SM 区域 T 细胞轨道的共聚焦图像。箭头头和线条示单个 KI67 + 细胞，下方为高倍放大显微图。

体内验证方面，在 Ccl19-iEYFP 小鼠中，命运标记的 FRCs 在肿瘤内形成单克隆细胞簇(图 5Q)，证实其通过克隆性增殖扩大免疫微环境，且 PRCs 与 TRCs 分别起源于SMC/PC 和 AdvFBs(图 5N-P)。

图 4. 非小细胞肺癌中成纤维网状细胞的分化轨迹

(A)使用 Monocle3 算法计算的分化轨迹 T1(a 和 b)和 T2 的 UMAP 表示，投影于CCL19 + 成纤维细胞亚群。(B)UMAP 描绘投影于 CCL19 + 成纤维细胞亚群的伪时间。(C)特征 UMAP 显示沿轨迹 T1 表达的基因。(D)NSCLC 的 CM 区域 TLS 的共聚焦图像。(E)特征UMAP 显示沿轨迹 T1 表达的指定基因。(F)NSCLC 的 CM 区域 TLS 和血管周围微环境的共聚焦图像。(G)沿子轨迹 T1b 表达的基因的特征UMAP 表示。(H)NSCLC 的 CM 区域 TLS 的共聚焦图像。(I)沿子轨迹 T2 表达的基因的特征 UMAP 表示。(J)CM 外膜区域的共聚焦图像。(K)(J)中所示 TLS 的共聚焦图像，方框区域为右侧高倍放大图像。(L)NSCLC 中表达 CCL19 的成纤维细胞分化轨迹示意图。

FRC-T 细胞互作网络调控 T 细胞活化与分化

通过 CellChat 算法解析，FRCs与 CD8+ T 细胞存在 3 类关键互作。在迁移引导方面，PRCs 通过 CXCL12-CXCR4 轴(配体 - 受体对表达率 68%)及VCAM1-ITGA4(59%)促进 T 细胞黏附于血管壁，TRCs 则通过 CCL19-CCR7 轴(72%)引导 T 细胞向 TLS 聚集(图 3G、S3D)。在活化维持方面，TRCs表达 LTBR 配体(LTA/LTB)及 IFN-γ 响应基因(如 IDO1)，通过 TNFRSF14 信号维持 CD8+ T 细胞效应表型(GZMB + 细胞比例：FRC 完整组45.2% vs. 消融组 21.7%，p<0.001，图 7L)。在干性保护方面，在 TLS 中，TRCs 与 TCF7 +干细胞样 T 细胞形成膜接触(图 3K)，通过 NOTCH3-Jagged1 通路抑制 T 细胞耗竭(PD1 + 细胞比例：FRC 完整组28.5% vs. 消融组 52.1%，p<0.001，图 7N)。

图 5. 小鼠肺肿瘤中表达 Ccl19 的成纤维网状细胞亚群

(A)实验方法示意图。(B)Ccl19-EYFP 小鼠胸膜下区域表达 TOMATO(TOM+)的 LLC-gp33 肿瘤的共聚焦图像。(C 和 D)LLC-gp33 肿瘤中血管周围微环境(C)和 T 细胞轨道(D)的共聚焦图像。(E)从未受影响肺组织和第 23 天切除的LLC-gp33 肿瘤中 sort 的 Ccl19-EYFP + 细胞的 scRNA-seq 分析的 UMAP 表示。(F)点图显示成纤维细胞和 FRC 相关基因的平均表达。(G 和 H)第 23 天 LLC-gp33 肿瘤中 T 细胞轨道(G)和血管周围微环境(H)的共聚焦图像。(I)第 15 天 Ccl19-EYFP 小鼠胸膜下区域 LLC-gp33 肿瘤病变(TOM+)的共聚焦图像。(J)第 15 天 LLC-gp33 肿瘤病变中 EYFP + 成纤维细胞和 CD8+ T 细胞的共聚焦图像。(K)从未受影响肺组织、肿瘤细胞注射后第 15 天肺组织(红色细胞)和第 23 天切除的 LLC-gp33 肿瘤中 sort 的 Ccl19-EYFP + 细胞的 UMAP 表示。(L)基于Slingshot 算法推断的分化轨迹 T1 和 T2 的 UMAP 表示。(M)通过向可诱导的Ccl19-iEYFP 和 Ccl19-iBbw 小鼠注射LLC-gp33 细胞并在肿瘤细胞注射后第 15 天用多西环素处理，进行 FRC 命运 mapping 实验。(N)如(L)中的 Ccl19-EYFP + 细胞的 UMAP 表示，并投影从多西环素处理的 LLC-gp33 肿瘤中 sort 的 Ccl19-iEYFP + 细胞(红色，fm：命运标记细胞)。(O 和 P)多西环素处理的 Ccl19-iEYFP 小鼠第 23 天 LLC-gp33 肿瘤中 T 细胞轨道(O)和血管周围微环境(P)的共聚焦图像。(Q)多西环素处理的 Ccl19-iBbw 小鼠第 23 天 LLC-gp33 肿瘤的共聚焦图像。

FRCs 缺失导致抗肿瘤免疫功能衰竭

在 Ccl19-EYFP/DTR 小鼠中，白喉毒素消融 FRC 前体细胞后，多项指标显示抗肿瘤免疫功能受损。T 细胞浸润显著减少，肿瘤内 CD8+ T 细胞密度下降 62%(p<0.001，图 7B)，TLS 形成失败，T 细胞轨道数量减少81%(图 S6C)。效应功能方面，肿瘤特异性 CD8+ T 细胞(gp33 tetramer+)中，IFNγ+ 细胞比例从 38.7% 降至 12.1%(p<0.001，图 7K)，颗粒酶B(GZMB)表达量降低 59%(图 7L)。肿瘤进展方面，肺肿瘤重量增加 58%(p=0.0012，图 7D)，转移结节数量增加 73%(p=0.0001，图 7E)，提示 FRCs 是维持抗肿瘤免疫的必要条件。

图 6. 冠状病毒载体免疫治疗中表达 Ccl19 的成纤维网状细胞亚群

(A)实验方法示意图。(B)mCOV-Flt3l-gp33 免疫后第 23 天 LLC-gp33 肿瘤(TOMATO+)的共聚焦图像。(C)免疫后 LLC-gp33 肿瘤边缘区域的共聚焦图像。(D)免疫后第 23 天 LLC-gp33肿瘤边缘 TLS 的共聚焦图像。(E)多维标度(MDS)图显示 mCOV-Flt3l-gp33 载体免疫小鼠肿瘤中 Ccl19-EYFP + 成纤维细胞亚群(三角形)与未免疫小鼠肿瘤和肺细胞(十字)的转录相似性。(F)点图显示 mCOV-Flt3l-gp33 载体免疫小鼠(第 23 天)LLC-gp33 肿瘤中Ccl19-EYFP + 成纤维细胞亚群的特征基因平均表达。(G)基于 Slingshot 算法推断的分化轨迹，投影于 mCOV-Flt3l-gp33 载体免疫小鼠 LLC-gp33 肿瘤中 Ccl19-EYFP + 细胞的 scRNA-seq 分析的 UMAP 表示。(H)沿伪时间表达的指定基因，细胞按伪时间排序。(I)命运 mapping 方法示意图。(J)第23 天 TLS 的共聚焦图像，示命运标记的肿瘤 FRCs。

免疫治疗通过诱导 FRCs 增强 T 细胞应答

在 mCOV-Flt3l-gp33 病毒载体治疗模型中，出现了 FRCs 相关的积极变化。TLS TRCs 特异性诱导方面，治疗组肿瘤边缘出现 CLU+ TLS TRCs 亚群，其 CXCL12 表达量较未治疗组高 2.3 倍(p<0.01，图 6F)，与 B 细胞区形成紧密互作。T细胞增殖方面，Ki67+ cycling CD8+ T 细胞比例从 15.3% 升至 32.7%(p<0.001，图 3L)，EdU 掺入率提高 28%，表明 FRCs 促进 T 细胞克隆扩张。治疗效果方面，在 FRCs 完整小鼠中，病毒治疗使肿瘤体积缩小 41%，而 FRCs 消融组无显著变化(图 7B)，证实 FRCs 是免疫治疗起效的关键基质基础。

图 7. 表达 Ccl19 的成纤维网状细胞控制抗肿瘤 T 细胞应答

(A)实验方法示意图。(B)mCOV-Flt3l-gp33 处理的 LLC-gp33 肿瘤第 23 天的共聚焦图像。(C)通过四聚体染色和流式细胞术分析 GP33/34+ CD8+ T 细胞(n≥7，3 次独立实验)。(D)计算荷瘤肺的净肿瘤重量(减去未受影响肺的平均重量)(n≥7，3 次独立实验)。数据表示为平均值 ± 标准差。(E)显微镜检查评估指定小鼠左肺叶的肿瘤结节数量(n≥7，3 次独立实验)。(F)mCOV-Flt3l-gp33 免疫后第 23 天，从 DTR - 和 DTR + 肺中sort 的 gp33/34 四聚体 + CD8+ T 细胞的 scRNA-seq 分析的 UMAP 表示。 (G 和 H)基于 DTR - 肺与 DTR + 肺效应 CD8+ T 细胞中差异表达基因，DTR + 肺中耗竭(G)和增殖(H)CD8+ T 细胞富集的基因集。(I)实验方法示意图。(J)流式细胞术计数 DTR - 和DTR + 肺中 CD8+ CD45.1+ P14 细胞(n=8)。数据表示为平均值 ± 标准差。(K)流式细胞术测定P14 细胞中 IFNG + 和 TNF

总结

本研究系统揭示了肺癌中 FRCs 的双重角色 —— 作为结构组织者构建互联 T 细胞微环境，作为免疫调控者驱动 T 细胞活化与分化。通过临床样本多组学分析与小鼠功能验证，首次明确 PRCs/TRCs的血管周 / 间质分化路径及其对 T 细胞干性、效应功能的分级调控机制。研究发现，FRCs 缺失导致 T 细胞耗竭与免疫治疗抵抗，而诱导 FRCs 向 TRCs 极化可增强抗肿瘤免疫应答。这些发现不仅填补了 TME 中成纤维细胞功能研究的空白，更为靶向调控肿瘤免疫微环境提供了新方向 —— 通过干预 FRCs 分化路径(如激活 NOTCH3 或阻断 TGFβ 信号)或增强 CCL19-CCR7 轴功能，有望开发新型免疫联合疗法，改善肺癌患者预后。

参考文献

Onder L, Papadopoulou C, Lütge A, et al. Fibroblastic reticular cells generate protective intratumoral T cell environments in lung cancer[J]. Cell, 2025, 188(2): 430-446. e20.