导语：在B细胞恶性肿瘤(如急性淋巴细胞白血病、弥漫大B细胞淋巴瘤)的治疗中，基于T细胞的免疫疗法(如CAR-T细胞治疗)虽显著改善了部分患者的预后，但长期缓解率仍不理想，约50%患者会在治疗后一年内复发，抗原逃逸(如CD19丢失)和肿瘤细胞代谢异常是主要挑战。此外，恶性B细胞虽增殖迅速却面临线粒体功能不足，高效ATP合成是其生存必需，而调控这一代谢过程的关键分子机制尚未明确。RNA修饰及其结合蛋白在肿瘤中的作用日益受到关注，但YTHDF2作为兼具m⁵C和m⁶A修饰识别能力的双重阅读器，其在B细胞恶性肿瘤中的具体功能仍未被系统解析。
2025年1月，Cell杂志发表了一篇题为“YTHDF2 promotes ATP synthesis and immune evasion in B cell malignancies”的文章，首次揭示YTHDF2通过稳定m⁵C修饰的ATP 合成相关基因(如ATP5PB/MG/MF)增强肿瘤细胞能量代谢，并通过降解m⁶A修饰的免疫相关基因(如CD19、HLA-DMA/B)逃避免疫监视的双重机制，为克服当前治疗瓶颈提供了新视角。
多维度实验揭示YTHDF2作用网络抑制剂联合疗法验证临床潜力
本研究是一项基础与转化结合的机制验证研究，旨在阐明YTHDF2在B细胞恶性肿瘤中的分子机制并探索其作为治疗靶点的潜力。研究首先通过分析超2000例患者的RNA测序数据，发现YTHDF2在B细胞恶性肿瘤中显著高表达，且与预后不良相关。随后利用CRISPR-Cas9技术构建YTHDF2敲除/敲低的细胞模型，结合代谢组学、RNA免疫沉淀测序(RIP-seq)及甲基化RNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)，解析其对mRNA稳定性的调控机制。动物实验则通过PDX模型和基因编辑小鼠，验证YTHDF2对肿瘤生长和免疫微环境的影响。
实验分组包括：YTHDF2敲除组与对照组的细胞增殖、代谢功能对比;YTHDF2抑制剂CCI-38单药及联合CAR-T细胞治疗的体内外疗效评估;m⁵C和m⁶A修饰相关蛋白互作机制验证(如PABPC1、CNOT1/6)。主要评价指标包括细胞ATP水平、线粒体呼吸功能、免疫细胞杀伤效率、肿瘤负荷及小鼠生存期，次要指标涉及RNA修饰位点鉴定、蛋白-蛋白相互作用验证等。
YTHDF2双重机制驱动肿瘤进展抑制剂联合疗法显著增效
▌YTHDF2在B细胞恶性肿瘤中高表达，其水平与不良预后显著相关
通过分析超2000例B-ALL患者的RNA-seq数据，研究发现YTHDF2是所有m⁶A相关基因中表达上调最显著的基因(图1A-B)。在DLBCL患者中，无论是生发中心B细胞样(GCB)还是活化B细胞样(ABC)亚型，YTHDF2 mRNA水平均显著高于正常扁桃体B细胞，尤其在生发中心亮区(LZ)B细胞中表达更高(图1D-E)。生存分析显示，YTHDF2高表达与B-ALL、DLBCL、套细胞淋巴瘤(MCL)患者的总生存期(OS)、无事件生存期(EFS)缩短显著相关(P<0.05，图1F)。在蛋白水平，YTHDF2在恶性B细胞中的表达显著高于健康对照及AML细胞(图1G-H)，提示其在B细胞恶性肿瘤中的特异性致癌作用。
图1. YTHDF2在B细胞恶性肿瘤中高表达并发挥致癌作用
(A)B-ALL患者中m⁶A相关基因表达模式热图³⁵。(B) 图A中YTHDF2的丰度分析。(C) DepMap数据库中YTHDF2的依赖评分。(D) DLBCL患者与健康对照的YTHDF2 mRNA丰度(左：GEO: GSE110669及phs00144436数据集;右：GEO: GSE38697中暗区 [DZ] 与亮区 [LZ] 生发中心B细胞对比)。(E) 正常与恶性B细胞中YTHDF2 mRNA的实时定量PCR验证。(F) 根据YTHDF2丰度分组的B-ALL³⁵、DLBCL(phs001444.v2.p1)及MCL(cBioPortal)患者的总生存期(OS)、无事件生存期(EFS)或无进展生存期(PFS)分析(对数秩检验)。(G-H) 白血病与健康细胞(G)、正常与恶性B细胞(H)的YTHDF2蛋白丰度(统计分析显示差异显著)。(I-K) 携带mCherry或RFP标记的恶性B细胞生长竞争实验(mCherry⁺或RFP⁺细胞比例变化)。(L-O) YTHDF2敲低(KD)对B-ALL细胞(L)、淋巴瘤细胞(M)、B-ALL-PDX细胞(N)及BCR-ABL1转化的B-ALL细胞中Ythdf2条件敲除(cKO)后的细胞生长影响(O，Cre-ER⁺GFP载体转导后经4-羟基他莫昔芬处理)。(P-S) BCR-ABL1(P)或NRASᴳ¹²ᴰ(Q)驱动的B-ALL细胞中Ythdf2过表达或敲除后的生长竞争实验(R-S：携带puro-ER或puro-Cre-ERT²载体的细胞经GFP标记)。
▌YTHDF2缺失显著抑制恶性B细胞增殖与体内成瘤能力
CRISPR-Cas9敲除或shRNA敲低YTHDF2后，多种B-ALL(如RS4;11、KOPN-8)和淋巴瘤细胞(如SU-DHL-4、OCI-LY-3)的增殖能力显著下降，细胞周期阻滞于G0/G1期。在生长竞争实验中，YTHDF2缺失的细胞比例在10天内从50%降至10%-20%(图1I-K)。小鼠PDX模型显示，敲低YTHDF2的B-ALL细胞在NSG小鼠中的定植能力显著减弱，中位生存期从对照组的40天延长至65天(P<0.001，图2A-C)。进一步构建Ythdf2条件敲除(cKO)小鼠模型发现，在BCR-ABL1或NRAS⁰¹²ᴰ驱动的B-ALL中，Ythdf2缺失导致脾脏和骨髓中的白血病细胞负荷减少60%-80%(图2D-G)，证实其对肿瘤生长的必要性。
图2. 转录因子促进YTHDF2表达并在B细胞恶性肿瘤发展中起关键致癌作用
(A-C)YTHDF2敲低的复发B-ALL患者来源异种移植(PDX)细胞或Ythdf2 cKO的BCR-ABL1/NRASᴳ¹²ᴰ转化B-ALL细胞在免疫缺陷NSG小鼠中的定植抑制及白血病进展延迟(图A为PDX模型，图B-C为小鼠脾脏和肝脏肿瘤负荷)。(D-H) Ythdf2缺失的供体B-ALL细胞在免疫competent C57BL/6小鼠中失去致瘤能力，且Ythdf2缺失的受体小鼠显著延迟野生型B-ALL的进展(图D为移植实验设计，图E-H为骨髓和脾脏中供体细胞比例)。(I-J) 单细胞RNA测序显示Ythdf2 cKO后T细胞比例显著增加(UMAP分析，图I为细胞群分布，图J为T细胞比例量化)。(K-L) 正常前B细胞经Ythdf2(而非Ythdf3)过表达后转化为恶性B细胞并形成集落(图K为集落形成实验，图L为连续传代后的集落形成能力)。(M-P) NSG小鼠移植YTHDF2-WT转导的前B细胞后发展为典型B-ALL(图M为初级骨髓移植[BMT]，图N-O为次级BMT的肿瘤负荷及生存期)，而m⁶A结合缺陷突变体(m⁶A-MUT)虽可致瘤但潜伏期延长且白血病干细胞频率降低(图P)。(Q-R) 染色质免疫沉淀(ChIP)显示MYC、STAT3、POU2AF1在恶性B细胞中富集于YTHDF2启动子区域(图Q为ATAC-seq信号，图R为TF结合基序分析)。(S-T) TF敲低后YTHDF2表达显著下降(图S为蛋白水平，图T为mRNA相关性分析)。
▌YTHDF2通过稳定m⁵C修饰的ATP合成基因维持肿瘤能量代谢
转录组与代谢组联合分析显示，YTHDF2缺失导致线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)通路显著下调，ATP水平下降约50%(图3E)。进一步筛选发现，ATP合酶亚基基因ATP5PB、ATP5MG、ATP5MF的mRNA稳定性依赖YTHDF2。RIP-seq和MeRIP-seq证实，YTHDF2通过识别这些基因的m⁵C修饰位点，招募PABPC1蛋白抑制mRNA降解，半衰期从对照组的1.2小时延长至2.5小时(图4M)。敲低ATP5PB/MG/MF导致肿瘤细胞氧消耗率(OCR)降低40%-60%，ATP水平下降60%，而同时过表达这三个基因可完全逆转YTHDF2缺失引起的代谢缺陷(图3Q-S)。体内实验显示，ATP5PB/MG/MF敲低使PDX小鼠肿瘤体积缩小55%，生存期延长30%(图3P)。
图3. YTHDF2不依赖m⁶A修饰促进恶性B细胞ATP合成
(A-B)IAH8R细胞中YTHDF2调控基因与m⁶A修饰基因的韦恩图(A)及比例饼图(B)。(C) 非m⁶A修饰下调基因的KEGG通路富集桑基图(F型ATP酶基因富集最显著)。(D) 恶性B细胞中YTHDF2敲低后代谢相关通路富集气泡图(红色标注代谢通路)。(E-F) 代谢组学显示YTHDF2敲低后ATP含量显著下降(E)及ATP相关代谢物集合富集(F)。(G) 非m⁶A修饰下调转录本的整合通路分析(OXPHOS和TCA循环显著富集)。(H-I) 海马实验显示B-ALL-PDX细胞(左)及YTHDF2转导前B细胞(右)的氧消耗率(OCR)变化。(J) YTHDF2敲低后ATP5PB/MG/MF蛋白丰度下降。(K) 临床样本中YTHDF2与ATP5PB/MG/MF mRNA的相关性分析(皮尔逊相关系数)。(L-P) ATP5PB/MG/MF敲低抑制细胞生长、OCR及ATP合成，并延长PDX小鼠生存期(图L为蛋白水平，图M-P为功能实验)。(Q-S) 过表达ATP5PB/MG/MF可挽救YTHDF2敲低导致的代谢缺陷(图Q为ATP含量，图R为细胞生长，图S为OCR)。
▌YTHDF2通过降解m⁶A修饰的免疫相关基因介导免疫逃逸
作为m⁶A阅读器，YTHDF2直接结合CD19、HLA-DMA/B的m⁶A位点(如CD19外显子9、HLA-DMA外显子3)，通过招募CNOT1/6复合物加速mRNA降解。敲低YTHDF2使CD19细胞表面表达量从平均荧光强度(MFI)500提升至1500-2000，HLA-DMA/B表达量增加2-3倍(图5F-H)。功能实验表明，YTHDF2缺失的肿瘤细胞与CD19 CAR-T细胞的突触形成效率提升3倍，在效应细胞：靶细胞=1:10时，杀伤率从对照组的35%提升至78%(图5O-R)。在blinatumomab(CD3-CD19双抗)联合T细胞实验中，YTHDF2缺失组的肿瘤细胞清除率比对照组高45%(图5N)。
图4. YTHDF2通过招募PABPC1识别/稳定m⁵C修饰的mRNA
(A)YTHDF2突变体构建示意图(m⁶A-MUT、D-MUT、RNA-MUT)。(B) UHPLC-QQQ-MS检测YTHDF2突变体与m⁵C修饰RNA的结合能力(D-MUT和RNA-MUT结合显著降低)。(C) RIP实验显示YTHDF2结合的RNA中m⁵C丰度显著高于总RNA。(D) 重组YTHDF2蛋白与m⁶A/m⁵C修饰单链RNA的结合效率(荧光素标记pull-down实验)。(E-F) RIP-seq与m⁵C-MeRIP-seq的重叠分析(7,390个YTHDF2结合基因中63%为m⁵C修饰)。(G) YTHDF2结合位点在m⁵C修饰峰中的富集分析(距m⁵C峰距离分布)。(H-I) ATP5PB/MG/MF基因的m⁵C修饰位点验证(亚硫酸氢盐测序及纳米孔测序，图H为基因组位置，图I为修饰胞嘧啶置信度)。(J-L) MeRIP-qPCR、RNA pull-down及RIP-qPCR验证YTHDF2与m⁵C修饰ATP5PB/MG/MF的结合。(M) YTHDF2敲除后ATP5PB/MG/MF mRNA半衰期缩短(放线菌素D处理后半衰期测定)。(N-P) PABPC1表达与YTHDF2及靶基因的正相关性(图N 为临床样本，图O-P为蛋白水平)。(Q-R) PABPC1敲低抑制恶性B细胞生长及PDX小鼠白血病进展。(S-T) YTHDF2与PABPC1直接互作(Co-IP实验，图S为免疫共沉淀，图T为共结合基因富集代谢通路)。
▌小分子抑制剂CCI-38靶向YTHDF2逆转代谢与免疫双重缺陷
通过虚拟筛选与结构优化，鉴定出YTHDF2特异性抑制剂CCI-38(KD=10.1±0.978μM)。CCI-38处理使肿瘤细胞ATP水平下降40%，OCR降低50%，同时CD19表达量恢复至正常水平(图6M-O)。在携带复发CD19⁻ B-ALL的PDX小鼠中，CCI-38单药使肿瘤负荷降低42%，联合CAR-T细胞治疗则使小鼠生存期从45天延长至80天，且复发肿瘤中CD19阳性率从0%恢复至68%(图7I-K)。机制研究表明，CCI-38通过结合YTHDF2的m⁵C/m⁶A结合口袋，阻断其与RNA的相互作用，且对正常B细胞发育无显著影响(图6A-F)。
图5. YTHDF2 destabilizes m⁶A修饰的CD19和HLA-DMA/B，并增强T细胞免疫治疗效果
(A-B)YTHDF2敲低后上调基因的GO富集分析(免疫应答通路显著富集，图A)及KEGG通路分析(B细胞受体信号通路，图B)。(C-D) GSEA显示MHC-II蛋白复合物基因集富集(图C为富集分数，图D为基因分布)。(E) 临床样本中YTHDF2与CD19/HLA-DMA/B表达的负相关性( Pearson相关系数)。(F-H) YTHDF2敲低后CD19和HLA-DMA/B的mRNA稳定性(F)、细胞表面丰度(G-H，流式细胞术MFI值)显著增加。(I-J) BST-PCR定位CD19和HLA-DMA/B的m⁶A修饰位点(图I为外显子位置，图J为修饰丰度)。(K-L) 重组YTHDF2-WT与m⁶A修饰RNA的结合特异性(RNA pull-down实验，图K)及m⁶A标记验证(MeRIP-qPCR，图L)。(M-N) YTHDF2敲低增强blinatumomab联合T细胞对肿瘤的杀伤效率(图M为流式细胞术检测，图N为细胞计数)。(O-R) CD19 CAR-T细胞与YTHDF2缺失肿瘤细胞的突触形成增加(图O为共聚焦显微镜图像，图P-R为杀伤效率量化，效应细胞：靶细胞=1:10时杀伤率提升40%)。
▌YTHDF2的双重功能依赖不同RNA修饰结合域
突变分析显示，YTHDF2的m⁶A结合依赖W432、W486位点，而m⁵C结合需额外Y418、D422、W491位点。携带m⁶A结合缺陷突变(m⁶A-MUT)的YTHDF2仍能诱导B细胞转化，但成瘤潜伏期延长50%，白血病干细胞频率降低70%(图2M-P)，提示m⁵C介导的代谢调控是其核心致癌机制。相反，RNA结合全域突变(D-MUT)完全丧失转化能力，证实其功能依赖完整的RNA结合能力(图4A-C)。
图6. CCI-38作为高效YTHDF2抑制剂的鉴定
(A-B)虚拟筛选流程及化合物docking结果(79个化合物与YTHDF2 RNA结合域高评分结合，图A为结构模型，图B为化合物#38结合模式)。(C-D) DARTS实验显示CCI-38特异性结合YTHDF2(图C为蛋白酶保护实验，图D为解离常数KD测定)。(E-F) 荧光蛋白热迁移实验(FTSA)证实CCI-38与YTHDF2-WT结合，对突变体结合减弱(图E为熔解温度[Tm] 变化，图F为结合特异性)。(G-H) CCI-38抑制YTHDF2与m⁵C/m⁶A修饰RNA的结合(RNA pull-down实验，剂量依赖性阻断)。(I-J) CCI-38处理后m⁶A修饰基因(CD19/HLA-DMA/B)表达增加，m⁵C修饰基因(ATP5PB/MG/MF)表达降低(图I为流式细胞术，图J为蛋白水平)。(K-L) CCI-38联合CAR-T细胞治疗在PDX小鼠中的协同效应(图K为生物发光成像，图L为生存期分析，联合治疗组生存期延长78%)。
总结
本研究系统解析了YTHDF2在B细胞恶性肿瘤中的双重作用机制，揭示其通过代谢重编程和免疫逃逸的“双重打击”促进肿瘤进展。研究首次证实YTHDF2可作为m⁵C和m⁶A的双重阅读器，为RNA修饰在肿瘤中的功能研究提供了新范式。开发的小分子抑制剂CCI-38不仅能抑制肿瘤能量代谢，还能恢复免疫靶点表达，与CAR-T细胞疗法联用展现出显著协同效应，为解决临床中常见的抗原逃逸和代谢异常难题提供了极具潜力的治疗策略。
参考文献
Chen Z, Zeng C, Yang L, et al. YTHDF2 promotes ATP synthesis and immune evasion in B cell malignancies[J]. Cell, 2025, 188(2): 331-351. e30.
导语：在B细胞恶性肿瘤(如急性淋巴细胞白血病、弥漫大B细胞淋巴瘤)的治疗中，基于T细胞的免疫疗法(如CAR-T细胞治疗)虽显著改善了部分患者的预后，但长期缓解率仍不理想，约50%患者会在治疗后一年内复发，抗原逃逸(如CD19丢失)和肿瘤细胞代谢异常是主要挑战。此外，恶性B细胞虽增殖迅速却面临线粒体功能不足，高效ATP合成是其生存必需，而调控这一代谢过程的关键分子机制尚未明确。RNA修饰及其结合蛋白在肿瘤中的作用日益受到关注，但YTHDF2作为兼具m⁵C和m⁶A修饰识别能力的双重阅读器，其在B细胞恶性肿瘤中的具体功能仍未被系统解析。
2025年1月，Cell杂志发表了一篇题为“YTHDF2 promotes ATP synthesis and immune evasion in B cell malignancies”的文章，首次揭示YTHDF2通过稳定m⁵C修饰的ATP 合成相关基因(如ATP5PB/MG/MF)增强肿瘤细胞能量代谢，并通过降解m⁶A修饰的免疫相关基因(如CD19、HLA-DMA/B)逃避免疫监视的双重机制，为克服当前治疗瓶颈提供了新视角。
多维度实验揭示YTHDF2作用网络抑制剂联合疗法验证临床潜力
本研究是一项基础与转化结合的机制验证研究，旨在阐明YTHDF2在B细胞恶性肿瘤中的分子机制并探索其作为治疗靶点的潜力。研究首先通过分析超2000例患者的RNA测序数据，发现YTHDF2在B细胞恶性肿瘤中显著高表达，且与预后不良相关。随后利用CRISPR-Cas9技术构建YTHDF2敲除/敲低的细胞模型，结合代谢组学、RNA免疫沉淀测序(RIP-seq)及甲基化RNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)，解析其对mRNA稳定性的调控机制。动物实验则通过PDX模型和基因编辑小鼠，验证YTHDF2对肿瘤生长和免疫微环境的影响。
实验分组包括：YTHDF2敲除组与对照组的细胞增殖、代谢功能对比;YTHDF2抑制剂CCI-38单药及联合CAR-T细胞治疗的体内外疗效评估;m⁵C和m⁶A修饰相关蛋白互作机制验证(如PABPC1、CNOT1/6)。主要评价指标包括细胞ATP水平、线粒体呼吸功能、免疫细胞杀伤效率、肿瘤负荷及小鼠生存期，次要指标涉及RNA修饰位点鉴定、蛋白-蛋白相互作用验证等。
YTHDF2双重机制驱动肿瘤进展抑制剂联合疗法显著增效
▌YTHDF2在B细胞恶性肿瘤中高表达，其水平与不良预后显著相关
通过分析超2000例B-ALL患者的RNA-seq数据，研究发现YTHDF2是所有m⁶A相关基因中表达上调最显著的基因(图1A-B)。在DLBCL患者中，无论是生发中心B细胞样(GCB)还是活化B细胞样(ABC)亚型，YTHDF2 mRNA水平均显著高于正常扁桃体B细胞，尤其在生发中心亮区(LZ)B细胞中表达更高(图1D-E)。生存分析显示，YTHDF2高表达与B-ALL、DLBCL、套细胞淋巴瘤(MCL)患者的总生存期(OS)、无事件生存期(EFS)缩短显著相关(P<0.05，图1F)。在蛋白水平，YTHDF2在恶性B细胞中的表达显著高于健康对照及AML细胞(图1G-H)，提示其在B细胞恶性肿瘤中的特异性致癌作用。
图1. YTHDF2在B细胞恶性肿瘤中高表达并发挥致癌作用
(A)B-ALL患者中m⁶A相关基因表达模式热图³⁵。(B) 图A中YTHDF2的丰度分析。(C) DepMap数据库中YTHDF2的依赖评分。(D) DLBCL患者与健康对照的YTHDF2 mRNA丰度(左：GEO: GSE110669及phs00144436数据集;右：GEO: GSE38697中暗区 [DZ] 与亮区 [LZ] 生发中心B细胞对比)。(E) 正常与恶性B细胞中YTHDF2 mRNA的实时定量PCR验证。(F) 根据YTHDF2丰度分组的B-ALL³⁵、DLBCL(phs001444.v2.p1)及MCL(cBioPortal)患者的总生存期(OS)、无事件生存期(EFS)或无进展生存期(PFS)分析(对数秩检验)。(G-H) 白血病与健康细胞(G)、正常与恶性B细胞(H)的YTHDF2蛋白丰度(统计分析显示差异显著)。(I-K) 携带mCherry或RFP标记的恶性B细胞生长竞争实验(mCherry⁺或RFP⁺细胞比例变化)。(L-O) YTHDF2敲低(KD)对B-ALL细胞(L)、淋巴瘤细胞(M)、B-ALL-PDX细胞(N)及BCR-ABL1转化的B-ALL细胞中Ythdf2条件敲除(cKO)后的细胞生长影响(O，Cre-ER⁺GFP载体转导后经4-羟基他莫昔芬处理)。(P-S) BCR-ABL1(P)或NRASᴳ¹²ᴰ(Q)驱动的B-ALL细胞中Ythdf2过表达或敲除后的生长竞争实验(R-S：携带puro-ER或puro-Cre-ERT²载体的细胞经GFP标记)。
▌YTHDF2缺失显著抑制恶性B细胞增殖与体内成瘤能力
CRISPR-Cas9敲除或shRNA敲低YTHDF2后，多种B-ALL(如RS4;11、KOPN-8)和淋巴瘤细胞(如SU-DHL-4、OCI-LY-3)的增殖能力显著下降，细胞周期阻滞于G0/G1期。在生长竞争实验中，YTHDF2缺失的细胞比例在10天内从50%降至10%-20%(图1I-K)。小鼠PDX模型显示，敲低YTHDF2的B-ALL细胞在NSG小鼠中的定植能力显著减弱，中位生存期从对照组的40天延长至65天(P<0.001，图2A-C)。进一步构建Ythdf2条件敲除(cKO)小鼠模型发现，在BCR-ABL1或NRAS⁰¹²ᴰ驱动的B-ALL中，Ythdf2缺失导致脾脏和骨髓中的白血病细胞负荷减少60%-80%(图2D-G)，证实其对肿瘤生长的必要性。
图2. 转录因子促进YTHDF2表达并在B细胞恶性肿瘤发展中起关键致癌作用
(A-C)YTHDF2敲低的复发B-ALL患者来源异种移植(PDX)细胞或Ythdf2 cKO的BCR-ABL1/NRASᴳ¹²ᴰ转化B-ALL细胞在免疫缺陷NSG小鼠中的定植抑制及白血病进展延迟(图A为PDX模型，图B-C为小鼠脾脏和肝脏肿瘤负荷)。(D-H) Ythdf2缺失的供体B-ALL细胞在免疫competent C57BL/6小鼠中失去致瘤能力，且Ythdf2缺失的受体小鼠显著延迟野生型B-ALL的进展(图D为移植实验设计，图E-H为骨髓和脾脏中供体细胞比例)。(I-J) 单细胞RNA测序显示Ythdf2 cKO后T细胞比例显著增加(UMAP分析，图I为细胞群分布，图J为T细胞比例量化)。(K-L) 正常前B细胞经Ythdf2(而非Ythdf3)过表达后转化为恶性B细胞并形成集落(图K为集落形成实验，图L为连续传代后的集落形成能力)。(M-P) NSG小鼠移植YTHDF2-WT转导的前B细胞后发展为典型B-ALL(图M为初级骨髓移植[BMT]，图N-O为次级BMT的肿瘤负荷及生存期)，而m⁶A结合缺陷突变体(m⁶A-MUT)虽可致瘤但潜伏期延长且白血病干细胞频率降低(图P)。(Q-R) 染色质免疫沉淀(ChIP)显示MYC、STAT3、POU2AF1在恶性B细胞中富集于YTHDF2启动子区域(图Q为ATAC-seq信号，图R为TF结合基序分析)。(S-T) TF敲低后YTHDF2表达显著下降(图S为蛋白水平，图T为mRNA相关性分析)。
▌YTHDF2通过稳定m⁵C修饰的ATP合成基因维持肿瘤能量代谢
转录组与代谢组联合分析显示，YTHDF2缺失导致线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)通路显著下调，ATP水平下降约50%(图3E)。进一步筛选发现，ATP合酶亚基基因ATP5PB、ATP5MG、ATP5MF的mRNA稳定性依赖YTHDF2。RIP-seq和MeRIP-seq证实，YTHDF2通过识别这些基因的m⁵C修饰位点，招募PABPC1蛋白抑制mRNA降解，半衰期从对照组的1.2小时延长至2.5小时(图4M)。敲低ATP5PB/MG/MF导致肿瘤细胞氧消耗率(OCR)降低40%-60%，ATP水平下降60%，而同时过表达这三个基因可完全逆转YTHDF2缺失引起的代谢缺陷(图3Q-S)。体内实验显示，ATP5PB/MG/MF敲低使PDX小鼠肿瘤体积缩小55%，生存期延长30%(图3P)。
图3. YTHDF2不依赖m⁶A修饰促进恶性B细胞ATP合成
(A-B)IAH8R细胞中YTHDF2调控基因与m⁶A修饰基因的韦恩图(A)及比例饼图(B)。(C) 非m⁶A修饰下调基因的KEGG通路富集桑基图(F型ATP酶基因富集最显著)。(D) 恶性B细胞中YTHDF2敲低后代谢相关通路富集气泡图(红色标注代谢通路)。(E-F) 代谢组学显示YTHDF2敲低后ATP含量显著下降(E)及ATP相关代谢物集合富集(F)。(G) 非m⁶A修饰下调转录本的整合通路分析(OXPHOS和TCA循环显著富集)。(H-I) 海马实验显示B-ALL-PDX细胞(左)及YTHDF2转导前B细胞(右)的氧消耗率(OCR)变化。(J) YTHDF2敲低后ATP5PB/MG/MF蛋白丰度下降。(K) 临床样本中YTHDF2与ATP5PB/MG/MF mRNA的相关性分析(皮尔逊相关系数)。(L-P) ATP5PB/MG/MF敲低抑制细胞生长、OCR及ATP合成，并延长PDX小鼠生存期(图L为蛋白水平，图M-P为功能实验)。(Q-S) 过表达ATP5PB/MG/MF可挽救YTHDF2敲低导致的代谢缺陷(图Q为ATP含量，图R为细胞生长，图S为OCR)。
▌YTHDF2通过降解m⁶A修饰的免疫相关基因介导免疫逃逸
作为m⁶A阅读器，YTHDF2直接结合CD19、HLA-DMA/B的m⁶A位点(如CD19外显子9、HLA-DMA外显子3)，通过招募CNOT1/6复合物加速mRNA降解。敲低YTHDF2使CD19细胞表面表达量从平均荧光强度(MFI)500提升至1500-2000，HLA-DMA/B表达量增加2-3倍(图5F-H)。功能实验表明，YTHDF2缺失的肿瘤细胞与CD19 CAR-T细胞的突触形成效率提升3倍，在效应细胞：靶细胞=1:10时，杀伤率从对照组的35%提升至78%(图5O-R)。在blinatumomab(CD3-CD19双抗)联合T细胞实验中，YTHDF2缺失组的肿瘤细胞清除率比对照组高45%(图5N)。
图4. YTHDF2通过招募PABPC1识别/稳定m⁵C修饰的mRNA
(A)YTHDF2突变体构建示意图(m⁶A-MUT、D-MUT、RNA-MUT)。(B) UHPLC-QQQ-MS检测YTHDF2突变体与m⁵C修饰RNA的结合能力(D-MUT和RNA-MUT结合显著降低)。(C) RIP实验显示YTHDF2结合的RNA中m⁵C丰度显著高于总RNA。(D) 重组YTHDF2蛋白与m⁶A/m⁵C修饰单链RNA的结合效率(荧光素标记pull-down实验)。(E-F) RIP-seq与m⁵C-MeRIP-seq的重叠分析(7,390个YTHDF2结合基因中63%为m⁵C修饰)。(G) YTHDF2结合位点在m⁵C修饰峰中的富集分析(距m⁵C峰距离分布)。(H-I) ATP5PB/MG/MF基因的m⁵C修饰位点验证(亚硫酸氢盐测序及纳米孔测序，图H为基因组位置，图I为修饰胞嘧啶置信度)。(J-L) MeRIP-qPCR、RNA pull-down及RIP-qPCR验证YTHDF2与m⁵C修饰ATP5PB/MG/MF的结合。(M) YTHDF2敲除后ATP5PB/MG/MF mRNA半衰期缩短(放线菌素D处理后半衰期测定)。(N-P) PABPC1表达与YTHDF2及靶基因的正相关性(图N 为临床样本，图O-P为蛋白水平)。(Q-R) PABPC1敲低抑制恶性B细胞生长及PDX小鼠白血病进展。(S-T) YTHDF2与PABPC1直接互作(Co-IP实验，图S为免疫共沉淀，图T为共结合基因富集代谢通路)。
▌小分子抑制剂CCI-38靶向YTHDF2逆转代谢与免疫双重缺陷
通过虚拟筛选与结构优化，鉴定出YTHDF2特异性抑制剂CCI-38(KD=10.1±0.978μM)。CCI-38处理使肿瘤细胞ATP水平下降40%，OCR降低50%，同时CD19表达量恢复至正常水平(图6M-O)。在携带复发CD19⁻ B-ALL的PDX小鼠中，CCI-38单药使肿瘤负荷降低42%，联合CAR-T细胞治疗则使小鼠生存期从45天延长至80天，且复发肿瘤中CD19阳性率从0%恢复至68%(图7I-K)。机制研究表明，CCI-38通过结合YTHDF2的m⁵C/m⁶A结合口袋，阻断其与RNA的相互作用，且对正常B细胞发育无显著影响(图6A-F)。
图5. YTHDF2 destabilizes m⁶A修饰的CD19和HLA-DMA/B，并增强T细胞免疫治疗效果
(A-B)YTHDF2敲低后上调基因的GO富集分析(免疫应答通路显著富集，图A)及KEGG通路分析(B细胞受体信号通路，图B)。(C-D) GSEA显示MHC-II蛋白复合物基因集富集(图C为富集分数，图D为基因分布)。(E) 临床样本中YTHDF2与CD19/HLA-DMA/B表达的负相关性( Pearson相关系数)。(F-H) YTHDF2敲低后CD19和HLA-DMA/B的mRNA稳定性(F)、细胞表面丰度(G-H，流式细胞术MFI值)显著增加。(I-J) BST-PCR定位CD19和HLA-DMA/B的m⁶A修饰位点(图I为外显子位置，图J为修饰丰度)。(K-L) 重组YTHDF2-WT与m⁶A修饰RNA的结合特异性(RNA pull-down实验，图K)及m⁶A标记验证(MeRIP-qPCR，图L)。(M-N) YTHDF2敲低增强blinatumomab联合T细胞对肿瘤的杀伤效率(图M为流式细胞术检测，图N为细胞计数)。(O-R) CD19 CAR-T细胞与YTHDF2缺失肿瘤细胞的突触形成增加(图O为共聚焦显微镜图像，图P-R为杀伤效率量化，效应细胞：靶细胞=1:10时杀伤率提升40%)。
▌YTHDF2的双重功能依赖不同RNA修饰结合域
突变分析显示，YTHDF2的m⁶A结合依赖W432、W486位点，而m⁵C结合需额外Y418、D422、W491位点。携带m⁶A结合缺陷突变(m⁶A-MUT)的YTHDF2仍能诱导B细胞转化，但成瘤潜伏期延长50%，白血病干细胞频率降低70%(图2M-P)，提示m⁵C介导的代谢调控是其核心致癌机制。相反，RNA结合全域突变(D-MUT)完全丧失转化能力，证实其功能依赖完整的RNA结合能力(图4A-C)。
图6. CCI-38作为高效YTHDF2抑制剂的鉴定
(A-B)虚拟筛选流程及化合物docking结果(79个化合物与YTHDF2 RNA结合域高评分结合，图A为结构模型，图B为化合物#38结合模式)。(C-D) DARTS实验显示CCI-38特异性结合YTHDF2(图C为蛋白酶保护实验，图D为解离常数KD测定)。(E-F) 荧光蛋白热迁移实验(FTSA)证实CCI-38与YTHDF2-WT结合，对突变体结合减弱(图E为熔解温度[Tm] 变化，图F为结合特异性)。(G-H) CCI-38抑制YTHDF2与m⁵C/m⁶A修饰RNA的结合(RNA pull-down实验，剂量依赖性阻断)。(I-J) CCI-38处理后m⁶A修饰基因(CD19/HLA-DMA/B)表达增加，m⁵C修饰基因(ATP5PB/MG/MF)表达降低(图I为流式细胞术，图J为蛋白水平)。(K-L) CCI-38联合CAR-T细胞治疗在PDX小鼠中的协同效应(图K为生物发光成像，图L为生存期分析，联合治疗组生存期延长78%)。
总结
本研究系统解析了YTHDF2在B细胞恶性肿瘤中的双重作用机制，揭示其通过代谢重编程和免疫逃逸的“双重打击”促进肿瘤进展。研究首次证实YTHDF2可作为m⁵C和m⁶A的双重阅读器，为RNA修饰在肿瘤中的功能研究提供了新范式。开发的小分子抑制剂CCI-38不仅能抑制肿瘤能量代谢，还能恢复免疫靶点表达，与CAR-T细胞疗法联用展现出显著协同效应，为解决临床中常见的抗原逃逸和代谢异常难题提供了极具潜力的治疗策略。
参考文献
Chen Z, Zeng C, Yang L, et al. YTHDF2 promotes ATP synthesis and immune evasion in B cell malignancies[J]. Cell, 2025, 188(2): 331-351. e30.
