导语：为何许多患者对PD-1/PD-L1抑制剂无反应，甚至产生耐药性？免疫检查点抑制剂总体响应率仍不尽如人意，某些肿瘤类型更是难以攻克。最近发表的一项研究揭示隐藏在肿瘤耐药性背后的神秘机制，为临床带来新的思路。

肿瘤免疫治疗，尤其是针对PD-1/PD-L1通路的抑制剂，已成为多种晚期肿瘤治疗的重要手段，但其临床应用仍面临挑战。尽管这些药物在部分患者中疗效显著，但总体响应率较低，通常仅在10%到30%之间。此外，某些肿瘤类型，如前列腺癌和胰腺癌，对PD-1/PD-L1抑制剂表现出明显的耐药性。这种低响应率和耐药性的出现，严重限制了免疫检查点抑制剂的广泛应用。

细胞外囊泡（EVs）在肿瘤微环境中发挥着重要作用，它们能够携带多种生物活性分子，包括PD-L1等免疫检查点蛋白，从而在肿瘤免疫逃逸中扮演关键角色。研究表明，肿瘤细胞分泌的EVs通过PD-L1与免疫细胞相互作用，抑制T细胞的活性，促进肿瘤的免疫逃逸。然而，PD-L1在EVs上的分选机制及其在抗PD-1疗法耐药性中的作用尚未完全明确。

2025年1月，浙江大学医学院蔡志坚教授、浙江农林大学冯华军教授和浙江中医药大学何煜舟教授团队共同在Cell Reports Medicine杂志发表了一篇题为“MFGE8 induces anti-PD-1 therapy resistance by promoting extracellular vesicle sorting of PD-L1”的研究，聚焦于肿瘤细胞分泌的EVs在抗PD-1疗法耐药性中的作用，特别是PD-L1如何被分选到EVs上及其调控机制。研究通过一系列实验，揭示了MFGE8在促进PD-L1的EV分选中的关键作用，并阐明了其背后的分子机制（图1），为克服抗PD-1疗法的耐药性提供了新的策略。

图1 本研究核心结果示意图

本研究通过一系列体内、外实验，系统地探讨了MFGE8如何通过影响PD-L1的细胞外囊泡分泌来介导抗PD-1疗法的耐药性。研究纳入了多种肿瘤细胞系，包括B16F10黑色素瘤细胞和4T1乳腺癌细胞，并通过CRISPR-Cas9技术构建了基因敲除细胞系。实验分组包括对照组、MFGE8过表达组、MFGE8敲除组以及抗PD-1治疗组。主要评价指标为肿瘤体积变化、细胞外囊泡中PD-L1的水平以及免疫细胞的功能变化。通过这些设计，研究旨在全面评估MFGE8在肿瘤耐药性中的作用，并探索其潜在的治疗应用。

TEV PD-L1介导抗PD-1疗法耐药性

研究人员通过抑制肿瘤细胞分泌的细胞外囊泡（TEVs），验证其在抗PD-1疗法耐药性中的作用。通过敲除Rab27a基因，抑制B16F10黑色素瘤和4T1乳腺癌细胞的TEV分泌，结果发现这些细胞对抗PD-1疗法的耐药性显著降低。其中，B16F10Rab27a^-/-和4T1Rab27a^-/-肿瘤在抗PD-1治疗中的体积增长显著低于野生型肿瘤（P＜0.001）。此外，通过Coro1a基因敲除进一步验证了TEVs在抗PD-1疗法耐药性中的作用，结果与Rab27a敲除组一致（P＜0.001，图1）。

注：A-C.肿瘤体积测量：B16F10或4T1肿瘤荷瘤小鼠（A-C）或4T1 Rab27a^-/-、B16F10 Rab27a^-/-（A和B），4T1 Coro1a^-/-或B16F10 Coro1a^-/-（C）肿瘤荷瘤小鼠接受抗PD-1治疗。肿瘤接种后7天（A和C）或14天（B）开始治疗；D、E. 抗PD-1治疗的LLC肿瘤荷瘤小鼠的肿瘤体积，分别用LLC-EVs、B16F10-EVs或B16F10 Pdl1^-/--EVs（D）或LLC-EVs或LLC-PD-L1-EVs（E）处理；F 肺癌和胃癌患者接受抗PD-1治疗后的循环EV PD-L1浓度；G 循环EV PD-L1低（Circ-EV PD-L1lo）和高（Circ-EV PD-L1hi）患者的无进展生存期

（PFS；肺癌）或总生存期（OS；胃癌）。

图1 TEV PD-L1介导抗PD-1疗法耐药性

PD-L1在EVs上的泛素化依赖性

PD-L1如何被分选到TEVs上？分析结果显示，PD-L1的泛素化是其分选到EVs上的关键步骤。通过沉默ESCRT-0亚单位HRS，显著减少了PD-L1在EVs上的水平，表明PD-L1的分选依赖于ESCRT介导的泛素化过程。HRS沉默后，PD-L1在EVs上的水平降低了约70%（P＜0.001）。此外，通过质谱分析发现，UBE4A是PD-L1的E3泛素连接酶，能够促进PD-L1的泛素化和EV分选。UBE4A过表达显著增加了PD-L1在EVs上的水平，而UBE4A敲除则相反（P＜0.001，图2）。

注：A. 纳流式细胞术检测指定EVs上的PD-L1；B-C. 流式细胞术评估经指定EVs处理的CFSE标记的CD8+ T细胞增殖（B）或4-WK TEVs（C）与抗PD-L1预处理的4-WK TEVs；D.纳流式细胞术评估CD45+、CD144+、CD41+、CD235a+或FAP+ TT-EVs在PD-L1+ TT-EVs中的比例。

图2PD-L1以泛素化依赖的方式被分选到EVs上

UBE4A介导的PD-L1泛素化

研究发现，UBE4A通过K75位点的泛素化促进PD-L1的EV分选。通过构建PD-L1的不同截短突变体，发现PD-L1D19-132突变体完全消除了PD-L1的泛素化（P＜0.001）。进一步的点突变分析表明，K75位点是UBE4A介导的PD-L1泛素化的关键位点。K75R突变显著降低了PD-L1在EVs上的水平，且对CD8⁺T细胞增殖的抑制作用减弱（P＜0.001，图3）。可见，UBE4A通过K75位点的泛素化促进PD-L1的EV分选，从而增强肿瘤的免疫逃逸能力。

注：B. 2-、3-、4周4T1肿瘤组织UBE4A蛋白（B）水平；C. UBE4A过表达的4T1细胞中PD-L1的泛素化；D. 在4T1细胞中，PD-L1或UBE4A被拉下后，通过Western blot检测UBE4A或PD-L1。

图3 UBE4A介导的泛素化负责PD-L1的EV分选

MFGE8在肿瘤进展中的作用

研究表明，随着肿瘤的进展，肿瘤细胞分泌的MFGE8水平显著增加，且与UBE4A的表达水平呈正相关（P＜0.001）。通过添加MFGE8，能够显著上调UBE4A的表达，进而增加PD-L1在EVs上的水平（P＜0.001）。此外，MFGE8通过激活αvβ3和αvβ5整合素信号通路，促进UBE4A的表达。使用Cilengitide阻断整合素信号通路，能够显著抑制MFGE8诱导的UBE4A上调（P＜0.001）。这表明，MFGE8通过激活整合素信号通路，上调UBE4A的表达，从而促进PD-L1在EVs上的富集，增强肿瘤的免疫逃逸能力。

本文通过系统的研究，证实了肿瘤细胞分泌的细胞外囊泡（TEVs）中的PD-L1是抗PD-1疗法耐药性的关键因素。MFGE8通过激活αvβ3和αvβ5整合素信号通路，上调UBE4A的表达，进而促进PD-L1的泛素化和EV分选。这一过程显著增强了TEVs的免疫抑制能力，导致抗PD-1疗法的耐药性。通过使用抗MFGE8中和抗体（如RM026），研究成功阻断了MFGE8的作用，降低了EVs中的PD-L1水平，从而克服了抗PD-1疗法的耐药性。这些发现不仅为理解肿瘤耐药机制提供了新的视角，还为开发新的治疗策略提供了重要线索。

参考文献

WANG W, CHEN J, WANG S, et al. MFGE8 induces anti-PD-1 therapy resistance by promoting extracellular vesicle sorting of PD-L1. Cell Rep Med. 2025:101922. DOI: 10.1016/j.xcrm.2024.101922.

导语：为何许多患者对PD-1/PD-L1抑制剂无反应，甚至产生耐药性？免疫检查点抑制剂总体响应率仍不尽如人意，某些肿瘤类型更是难以攻克。最近发表的一项研究揭示隐藏在肿瘤耐药性背后的神秘机制，为临床带来新的思路。

肿瘤免疫治疗，尤其是针对PD-1/PD-L1通路的抑制剂，已成为多种晚期肿瘤治疗的重要手段，但其临床应用仍面临挑战。尽管这些药物在部分患者中疗效显著，但总体响应率较低，通常仅在10%到30%之间。此外，某些肿瘤类型，如前列腺癌和胰腺癌，对PD-1/PD-L1抑制剂表现出明显的耐药性。这种低响应率和耐药性的出现，严重限制了免疫检查点抑制剂的广泛应用。

细胞外囊泡（EVs）在肿瘤微环境中发挥着重要作用，它们能够携带多种生物活性分子，包括PD-L1等免疫检查点蛋白，从而在肿瘤免疫逃逸中扮演关键角色。研究表明，肿瘤细胞分泌的EVs通过PD-L1与免疫细胞相互作用，抑制T细胞的活性，促进肿瘤的免疫逃逸。然而，PD-L1在EVs上的分选机制及其在抗PD-1疗法耐药性中的作用尚未完全明确。

2025年1月，浙江大学医学院蔡志坚教授、浙江农林大学冯华军教授和浙江中医药大学何煜舟教授团队共同在Cell Reports Medicine杂志发表了一篇题为“MFGE8 induces anti-PD-1 therapy resistance by promoting extracellular vesicle sorting of PD-L1”的研究，聚焦于肿瘤细胞分泌的EVs在抗PD-1疗法耐药性中的作用，特别是PD-L1如何被分选到EVs上及其调控机制。研究通过一系列实验，揭示了MFGE8在促进PD-L1的EV分选中的关键作用，并阐明了其背后的分子机制（图1），为克服抗PD-1疗法的耐药性提供了新的策略。

图1 本研究核心结果示意图

本研究通过一系列体内、外实验，系统地探讨了MFGE8如何通过影响PD-L1的细胞外囊泡分泌来介导抗PD-1疗法的耐药性。研究纳入了多种肿瘤细胞系，包括B16F10黑色素瘤细胞和4T1乳腺癌细胞，并通过CRISPR-Cas9技术构建了基因敲除细胞系。实验分组包括对照组、MFGE8过表达组、MFGE8敲除组以及抗PD-1治疗组。主要评价指标为肿瘤体积变化、细胞外囊泡中PD-L1的水平以及免疫细胞的功能变化。通过这些设计，研究旨在全面评估MFGE8在肿瘤耐药性中的作用，并探索其潜在的治疗应用。

TEV PD-L1介导抗PD-1疗法耐药性

研究人员通过抑制肿瘤细胞分泌的细胞外囊泡（TEVs），验证其在抗PD-1疗法耐药性中的作用。通过敲除Rab27a基因，抑制B16F10黑色素瘤和4T1乳腺癌细胞的TEV分泌，结果发现这些细胞对抗PD-1疗法的耐药性显著降低。其中，B16F10Rab27a^-/-和4T1Rab27a^-/-肿瘤在抗PD-1治疗中的体积增长显著低于野生型肿瘤（P＜0.001）。此外，通过Coro1a基因敲除进一步验证了TEVs在抗PD-1疗法耐药性中的作用，结果与Rab27a敲除组一致（P＜0.001，图1）。

注：A-C.肿瘤体积测量：B16F10或4T1肿瘤荷瘤小鼠（A-C）或4T1 Rab27a^-/-、B16F10 Rab27a^-/-（A和B），4T1 Coro1a^-/-或B16F10 Coro1a^-/-（C）肿瘤荷瘤小鼠接受抗PD-1治疗。肿瘤接种后7天（A和C）或14天（B）开始治疗；D、E. 抗PD-1治疗的LLC肿瘤荷瘤小鼠的肿瘤体积，分别用LLC-EVs、B16F10-EVs或B16F10 Pdl1^-/--EVs（D）或LLC-EVs或LLC-PD-L1-EVs（E）处理；F 肺癌和胃癌患者接受抗PD-1治疗后的循环EV PD-L1浓度；G 循环EV PD-L1低（Circ-EV PD-L1lo）和高（Circ-EV PD-L1hi）患者的无进展生存期

（PFS；肺癌）或总生存期（OS；胃癌）。

图1 TEV PD-L1介导抗PD-1疗法耐药性

PD-L1在EVs上的泛素化依赖性

PD-L1如何被分选到TEVs上？分析结果显示，PD-L1的泛素化是其分选到EVs上的关键步骤。通过沉默ESCRT-0亚单位HRS，显著减少了PD-L1在EVs上的水平，表明PD-L1的分选依赖于ESCRT介导的泛素化过程。HRS沉默后，PD-L1在EVs上的水平降低了约70%（P＜0.001）。此外，通过质谱分析发现，UBE4A是PD-L1的E3泛素连接酶，能够促进PD-L1的泛素化和EV分选。UBE4A过表达显著增加了PD-L1在EVs上的水平，而UBE4A敲除则相反（P＜0.001，图2）。

注：A. 纳流式细胞术检测指定EVs上的PD-L1；B-C. 流式细胞术评估经指定EVs处理的CFSE标记的CD8+ T细胞增殖（B）或4-WK TEVs（C）与抗PD-L1预处理的4-WK TEVs；D.纳流式细胞术评估CD45+、CD144+、CD41+、CD235a+或FAP+ TT-EVs在PD-L1+ TT-EVs中的比例。

图2PD-L1以泛素化依赖的方式被分选到EVs上

UBE4A介导的PD-L1泛素化

研究发现，UBE4A通过K75位点的泛素化促进PD-L1的EV分选。通过构建PD-L1的不同截短突变体，发现PD-L1D19-132突变体完全消除了PD-L1的泛素化（P＜0.001）。进一步的点突变分析表明，K75位点是UBE4A介导的PD-L1泛素化的关键位点。K75R突变显著降低了PD-L1在EVs上的水平，且对CD8⁺T细胞增殖的抑制作用减弱（P＜0.001，图3）。可见，UBE4A通过K75位点的泛素化促进PD-L1的EV分选，从而增强肿瘤的免疫逃逸能力。

注：B. 2-、3-、4周4T1肿瘤组织UBE4A蛋白（B）水平；C. UBE4A过表达的4T1细胞中PD-L1的泛素化；D. 在4T1细胞中，PD-L1或UBE4A被拉下后，通过Western blot检测UBE4A或PD-L1。

图3 UBE4A介导的泛素化负责PD-L1的EV分选

MFGE8在肿瘤进展中的作用

研究表明，随着肿瘤的进展，肿瘤细胞分泌的MFGE8水平显著增加，且与UBE4A的表达水平呈正相关（P＜0.001）。通过添加MFGE8，能够显著上调UBE4A的表达，进而增加PD-L1在EVs上的水平（P＜0.001）。此外，MFGE8通过激活αvβ3和αvβ5整合素信号通路，促进UBE4A的表达。使用Cilengitide阻断整合素信号通路，能够显著抑制MFGE8诱导的UBE4A上调（P＜0.001）。这表明，MFGE8通过激活整合素信号通路，上调UBE4A的表达，从而促进PD-L1在EVs上的富集，增强肿瘤的免疫逃逸能力。

本文通过系统的研究，证实了肿瘤细胞分泌的细胞外囊泡（TEVs）中的PD-L1是抗PD-1疗法耐药性的关键因素。MFGE8通过激活αvβ3和αvβ5整合素信号通路，上调UBE4A的表达，进而促进PD-L1的泛素化和EV分选。这一过程显著增强了TEVs的免疫抑制能力，导致抗PD-1疗法的耐药性。通过使用抗MFGE8中和抗体（如RM026），研究成功阻断了MFGE8的作用，降低了EVs中的PD-L1水平，从而克服了抗PD-1疗法的耐药性。这些发现不仅为理解肿瘤耐药机制提供了新的视角，还为开发新的治疗策略提供了重要线索。

参考文献

WANG W, CHEN J, WANG S, et al. MFGE8 induces anti-PD-1 therapy resistance by promoting extracellular vesicle sorting of PD-L1. Cell Rep Med. 2025:101922. DOI: 10.1016/j.xcrm.2024.101922.