小麦条锈病发生范围广、暴发性强、流行成灾频率高，常造成10-30%的小麦产量损失，甚至绝产，被农业农村部列入I类农作物病害。其病原菌作为活体营养专性寄生真菌，通过侵染结构吸器向小麦细胞分泌致病因子以抑制植物免疫，并向活体组织汲取营养物质。其侵染部位通常会出现叶绿素滞留，称为“绿岛”。绿岛的形成通常被认为有利于病原菌通过延长寄主细胞活性以促进营养吸收。然而，活体营养型专性寄生真菌如何诱导寄主绿岛形成以促进病害发生的分子机制仍然知之甚少。
近日，四川农业大学魏育明/许强教授团队联合西北农林科技大学王晓杰教授在Nature Communications在线发表了题为“A fungal pathogen suppresses host leaf senescence to increase infection”的研究论文，揭示了锈菌致病因子Pst_TTP1抑制TaTrx-TaSGR1模块介导的叶片衰老及ROS积累，促进小麦感条锈病。
研究发现，敲除TaSGR1或TaTrx减弱小麦对条锈菌的抗性。蛋白互作手段鉴定小麦滞绿蛋白TaSGR1与硫氧还蛋白TaTrx在叶绿体中相互作用，硫氧还蛋白TaTrx行使氧化还原功能催化TaSGR1由寡聚体向单体的转化，加速小麦组织衰老、H2O2积累和细胞死亡，增强了寄主抗性。而锈菌致病因子Pst_TTP1分泌到寄主细胞质中与与硫氧还蛋白TaTrx结合，阻止TaTrx向叶绿体的转运，进而抑制了叶绿体中TaTrx-TaSGR1级联反应。综上，该研究不仅阐明了植物利用叶绿体诱导活性氧促进叶片衰老以应对专性寄生真菌营养寄生的抗病机制。同时还发现了病原菌能够利用这一机制促进作物感病。本研究为合理利用精准编辑开发叶绿体功能、打破病原菌的操纵，有效减轻作物病害发生、发展奠定了理论基础。
以下是该研究的主要研究结果：
1. TaSGR1正调控小麦对条锈菌的抗性
前期研究筛选鉴定TaSGR1参与小麦抗条锈过程中，通过转基因TaSGR1OE株系接种强致病力的条锈菌株CYR31和CYR34后，与对照Fielder相比，条锈菌生物量显著降低了50%-60%，且产生显著的过敏性坏死反应。而且，过表达植株TaSGR1OE叶片中的叶绿素含量显著降低。组织细胞学观察，转基因TaSGR1OE株系接菌后产生大量ROS。而接种弱致病力条锈菌CYR23后，植株对条锈菌的抗病性减弱，tasgr1-ABD、tasgr1-AB和tasgr1-B植株均产生明显的夏孢子。基于这些结果，表明TaSGR1在抗条锈病中起正调控作用。
2. TaSGR1与叶绿体硫氧还蛋白TaTrx互作
运用酵母双杂交筛选获得TaSGR1互作蛋白TaTrx。酵母一对一验证二者是发生互作。TaTrx与TaSGR1的STAYGREEN结构域互作，而与TaSGR1的富含半胱氨酸区域不互作。BIFC检测到TaSGR1-TaTrx在叶绿体中有较强的互作荧光信号，免疫共沉淀表明TaSGR1蛋白与TaTrx有很强的相互作用。综上结果表明，TaSGR1与叶绿体中的TaTrx相互作用。在Fielder植株中基因编辑TaTrx，tatrx- ABD植株接种条锈菌CYR23后，出现零星的夏孢子，真菌生物量增加了60 % ，表明TaTrx的缺失影响了小麦对条锈菌的抗性。
3. TaTrx促进TaSGR1蛋白由寡聚体转变为单体
对TaSGR1结构进行分析，预测到一个保守的富含半胱氨酸的基序可能会形成二硫键（C241、C245、C247、C248和C253）。将5个半胱氨酸突变后（TaSGR15A），寡聚TaSGR1蛋白无法形成。在体外实验中，原核表达蛋白TaSGR1-His出现了寡聚化；用β-巯基乙醇处理后，仅检测到单体TaSGR1。在转基因TaSGR1OE株系中过表达TaTrx。TaTrx促进寡聚TaSGR1丰度的降低，但单体TaSGR1的丰度提高了，而酶活缺失突变体（TaTrxM）对此则没有影响。在转基因TaSGR1OE株系接菌后，TaSGR1单体丰度降低，表明TaSGR1可能被TaTrx从寡聚体还原为单体，而TaSGR1单体形式可能参与植物抗病反应。
4. Pst_TTP1阻止TaTrx进入叶绿体，抑制了TaSGR1的功能
对瞬时表达Pst_TTP1-HA-GFP或GFP的Fielder植株叶片进行细胞质叶绿体分离实验。在表达GFP叶片的细胞质中，使用anti-Trx抗体检测到TaTrx主要积累在叶绿体中，而在表达Pst_TTP1-HA-GFP的叶片中检测到TaTrx蛋白在细胞质大量积累，这些结果表明Pst_TTP1阻止TaTrx进入叶绿体。以tatrx编辑材料为背景，过表达TaTrx或TaTrxM进行回补实验，发现过表达TaTrx能够恢复材料的抗性，而TaTrxM 不能。在TaSGR1OE材料中表达Pst_TTP1和GUS、TaTrx和GUS以及TaTrx和Pst_TTP1，进行非变性凝胶电泳。结果发现瞬转TaTrx促进TaSGR1寡聚体的解聚。而瞬转Pst_TTP1抑制了TaSGR1的解聚。此外，还评估了Pst_TTP1对TaSGR1诱导的叶绿体ROS积累的影响。TaTrx和TaSGR1的共表达诱导叶绿体中ROS的大量积累。Pst_TTP1能够抑制TaSGR1介导的叶绿体ROS的产生。因此，Pst_TTP1可能通过干扰TaTrx在叶绿体中的定位，从而削弱TaSGR1的功能并抑制植物免疫。
5. Pst_TTP1-TaTrx-TaSGR1作用机制
在受条锈感染的植物细胞中，锈菌致病因子Pst_TTP1被分泌并转移到植物细胞质中，与叶绿体TaTrx硫氧还蛋白相互作用，阻止其进入叶绿体（图5）。进而阻止TaTrx催化TaSGR1寡聚体向单体的转化，减弱了TaSGR1的叶绿素酶活性，导致ROS积累减少，抑制了植物的防御反应。在邻近未感染的细胞中（无Pst_TTP1），TaTrx正常调节叶绿体内TaSGR1氧化还原状态，促进叶绿体ROS的积累（图5）。
图5 Pst_TTP1-TaTrx-TaSGR1模块的作用模型
四川农业大学在读博士研究生李悦和曲翔汝为论文共同第一作者。四川农业大学许强教授、魏育明教授和西北农林科技大学王晓杰教授为该论文的共同通讯作者。该研究获得了国家自然科学基金、四川省自然科学基金、西南作物基因资源发掘与利用国家重点实验室等的资助。
小麦族多组学网站：http://wheatomics.sdau.edu.cn
投稿、合作等邮箱：shengweima@icloud.com
（转自：小麦研究联盟）
小麦条锈病发生范围广、暴发性强、流行成灾频率高，常造成10-30%的小麦产量损失，甚至绝产，被农业农村部列入I类农作物病害。其病原菌作为活体营养专性寄生真菌，通过侵染结构吸器向小麦细胞分泌致病因子以抑制植物免疫，并向活体组织汲取营养物质。其侵染部位通常会出现叶绿素滞留，称为“绿岛”。绿岛的形成通常被认为有利于病原菌通过延长寄主细胞活性以促进营养吸收。然而，活体营养型专性寄生真菌如何诱导寄主绿岛形成以促进病害发生的分子机制仍然知之甚少。
近日，四川农业大学魏育明/许强教授团队联合西北农林科技大学王晓杰教授在Nature Communications在线发表了题为“A fungal pathogen suppresses host leaf senescence to increase infection”的研究论文，揭示了锈菌致病因子Pst_TTP1抑制TaTrx-TaSGR1模块介导的叶片衰老及ROS积累，促进小麦感条锈病。
研究发现，敲除TaSGR1或TaTrx减弱小麦对条锈菌的抗性。蛋白互作手段鉴定小麦滞绿蛋白TaSGR1与硫氧还蛋白TaTrx在叶绿体中相互作用，硫氧还蛋白TaTrx行使氧化还原功能催化TaSGR1由寡聚体向单体的转化，加速小麦组织衰老、H2O2积累和细胞死亡，增强了寄主抗性。而锈菌致病因子Pst_TTP1分泌到寄主细胞质中与与硫氧还蛋白TaTrx结合，阻止TaTrx向叶绿体的转运，进而抑制了叶绿体中TaTrx-TaSGR1级联反应。综上，该研究不仅阐明了植物利用叶绿体诱导活性氧促进叶片衰老以应对专性寄生真菌营养寄生的抗病机制。同时还发现了病原菌能够利用这一机制促进作物感病。本研究为合理利用精准编辑开发叶绿体功能、打破病原菌的操纵，有效减轻作物病害发生、发展奠定了理论基础。
以下是该研究的主要研究结果：
1. TaSGR1正调控小麦对条锈菌的抗性
前期研究筛选鉴定TaSGR1参与小麦抗条锈过程中，通过转基因TaSGR1OE株系接种强致病力的条锈菌株CYR31和CYR34后，与对照Fielder相比，条锈菌生物量显著降低了50%-60%，且产生显著的过敏性坏死反应。而且，过表达植株TaSGR1OE叶片中的叶绿素含量显著降低。组织细胞学观察，转基因TaSGR1OE株系接菌后产生大量ROS。而接种弱致病力条锈菌CYR23后，植株对条锈菌的抗病性减弱，tasgr1-ABD、tasgr1-AB和tasgr1-B植株均产生明显的夏孢子。基于这些结果，表明TaSGR1在抗条锈病中起正调控作用。
2. TaSGR1与叶绿体硫氧还蛋白TaTrx互作
运用酵母双杂交筛选获得TaSGR1互作蛋白TaTrx。酵母一对一验证二者是发生互作。TaTrx与TaSGR1的STAYGREEN结构域互作，而与TaSGR1的富含半胱氨酸区域不互作。BIFC检测到TaSGR1-TaTrx在叶绿体中有较强的互作荧光信号，免疫共沉淀表明TaSGR1蛋白与TaTrx有很强的相互作用。综上结果表明，TaSGR1与叶绿体中的TaTrx相互作用。在Fielder植株中基因编辑TaTrx，tatrx- ABD植株接种条锈菌CYR23后，出现零星的夏孢子，真菌生物量增加了60 % ，表明TaTrx的缺失影响了小麦对条锈菌的抗性。
3. TaTrx促进TaSGR1蛋白由寡聚体转变为单体
对TaSGR1结构进行分析，预测到一个保守的富含半胱氨酸的基序可能会形成二硫键（C241、C245、C247、C248和C253）。将5个半胱氨酸突变后（TaSGR15A），寡聚TaSGR1蛋白无法形成。在体外实验中，原核表达蛋白TaSGR1-His出现了寡聚化；用β-巯基乙醇处理后，仅检测到单体TaSGR1。在转基因TaSGR1OE株系中过表达TaTrx。TaTrx促进寡聚TaSGR1丰度的降低，但单体TaSGR1的丰度提高了，而酶活缺失突变体（TaTrxM）对此则没有影响。在转基因TaSGR1OE株系接菌后，TaSGR1单体丰度降低，表明TaSGR1可能被TaTrx从寡聚体还原为单体，而TaSGR1单体形式可能参与植物抗病反应。
4. Pst_TTP1阻止TaTrx进入叶绿体，抑制了TaSGR1的功能
对瞬时表达Pst_TTP1-HA-GFP或GFP的Fielder植株叶片进行细胞质叶绿体分离实验。在表达GFP叶片的细胞质中，使用anti-Trx抗体检测到TaTrx主要积累在叶绿体中，而在表达Pst_TTP1-HA-GFP的叶片中检测到TaTrx蛋白在细胞质大量积累，这些结果表明Pst_TTP1阻止TaTrx进入叶绿体。以tatrx编辑材料为背景，过表达TaTrx或TaTrxM进行回补实验，发现过表达TaTrx能够恢复材料的抗性，而TaTrxM 不能。在TaSGR1OE材料中表达Pst_TTP1和GUS、TaTrx和GUS以及TaTrx和Pst_TTP1，进行非变性凝胶电泳。结果发现瞬转TaTrx促进TaSGR1寡聚体的解聚。而瞬转Pst_TTP1抑制了TaSGR1的解聚。此外，还评估了Pst_TTP1对TaSGR1诱导的叶绿体ROS积累的影响。TaTrx和TaSGR1的共表达诱导叶绿体中ROS的大量积累。Pst_TTP1能够抑制TaSGR1介导的叶绿体ROS的产生。因此，Pst_TTP1可能通过干扰TaTrx在叶绿体中的定位，从而削弱TaSGR1的功能并抑制植物免疫。
5. Pst_TTP1-TaTrx-TaSGR1作用机制
在受条锈感染的植物细胞中，锈菌致病因子Pst_TTP1被分泌并转移到植物细胞质中，与叶绿体TaTrx硫氧还蛋白相互作用，阻止其进入叶绿体（图5）。进而阻止TaTrx催化TaSGR1寡聚体向单体的转化，减弱了TaSGR1的叶绿素酶活性，导致ROS积累减少，抑制了植物的防御反应。在邻近未感染的细胞中（无Pst_TTP1），TaTrx正常调节叶绿体内TaSGR1氧化还原状态，促进叶绿体ROS的积累（图5）。
图5 Pst_TTP1-TaTrx-TaSGR1模块的作用模型
四川农业大学在读博士研究生李悦和曲翔汝为论文共同第一作者。四川农业大学许强教授、魏育明教授和西北农林科技大学王晓杰教授为该论文的共同通讯作者。该研究获得了国家自然科学基金、四川省自然科学基金、西南作物基因资源发掘与利用国家重点实验室等的资助。
小麦族多组学网站：http://wheatomics.sdau.edu.cn
投稿、合作等邮箱：shengweima@icloud.com
（转自：小麦研究联盟）
