目的   在生产以Vero细胞为基质的液体人用狂犬病疫苗过程中，添加不同厂家的核酸酶，筛选合适的核酸酶处理条件，评价该条件下液体人用狂犬病疫苗的安全性。

方法   温度25 ℃、37 ℃下，向病毒液中加入酶解浓度为0.15、0.30 U/ml的核酸酶，经层析系统纯化后采用β-丙内酯灭活，制备成原液及成品。采用PCR法和ELISA分别检测原液DNA残留量和核酸酶残留量，筛选出酶解温度和酶解浓度；采用PCR法分析原液中Vero细胞残留DNA片段和检测残留量；通过NIH法检测成品的效价来评价免疫原性，开展SD大鼠单次给药毒性试验和大耳白兔肌肉刺激性试验评价产品安全性。

结果   筛选酶解浓度为0.15 U/ml，酶解温度为25 ℃；残留DNA符合中国药典2020年版要求，核酸酶残留量在试剂盒检测下限0.2 ng/ml以下；残留DNA大于221 bp片段占DNA总残留量的比例少于25%；大鼠毒性试验和大耳白兔给药后未见异常，组织病理学检查均未见病理学改变。

结论   筛选到合适的酶解温度和酶解浓度，可将Vero细胞的DNA酶解成较小的片段，降低Vero细胞DNA残留量；动物安全性试验评价安全可靠，为Vero细胞基质疫苗的研发与应用奠定理论依据。

Vero细胞作为经WHO批准的可用于人类疫苗生产的病毒培养基质，现已广泛应用于脊髓灰质炎灭活疫苗、口服轮状病毒疫苗、流感疫苗、乙型脑炎灭活疫苗和甲型肝炎灭活疫苗中。目前在中国境内生产上市的人用狂犬病疫苗使用的细胞基质主要为Vero细胞、人二倍体细胞和原代地鼠肾细胞。Vero细胞作为疫苗生产用连续传代细胞基质，其残留DNA是疫苗中的杂质，应尽量减少。疫苗中的宿主细胞DNA残留具有潜在的致瘤性，其致瘤的主要机制是显性癌基因（如myc、ras等）的诱导表达，DNA片段越小，其包含癌基因和其他功能序列的可能性就越小，去除残留DNA可降低具有编码活性DNA的潜在致瘤风险。故需对DNA残留需进行严格的质量控制，以提高制品的安全性。

核酸酶是来源于黏质沙雷菌、经基因工程改进的、多功能非动物源性内切核酸酶，可将不同的DNA或RNA链完全水解成小片段，且无蛋白水解活性，可在不破坏病毒蛋白衣壳的同时，将外部核酸杂质完全水解。本研究拟通过添加不同厂家来源、不同添加量的核酸酶，在不同作用温度下对狂犬病病毒液进行处理，筛选出合适的参数，达到将Vero细胞DNA水解为小片段、降低宿主细胞DNA残留量的目的。病毒液经层析系统纯化后采用β-丙内酯灭活，制备成原液及成品。再对确定参数生产出的产品开展动物安全性评价，为Vero细胞基质疫苗的研发和临床安全应用奠定理论依据。有文献报道，病毒液超滤时体积可浓缩1到100倍，而核酸酶在浓缩液中使用终浓度一般为1~50 U/ml。本研究将病毒液超滤浓缩50倍，按每毫升病毒液设计加入核酸酶0.15和0.30 U开展试验，符合使用终浓度的要求。

Bio-Pro600s全自动层析系统购自江苏汉邦科技有限公司，7500型qPCR仪、Multiskan FC酶标仪器购自赛默飞世尔（上海）仪器有限公司。

Vero细胞（来源于原中国药品生物制品检定所，传代至134代制成工作细胞库）、狂犬病病毒固定毒aGV株（来源于原中国药品生物制品检定所，传代至14代制成工作种子批）均由吉林惠康生物药业有限公司保存；人用狂犬病疫苗（批号：S202010003，规格1.0 ml/瓶）采用Vero细胞接种微载体的生物反应器技术制备，由吉林惠康生物药业有限公司提供。

型号Ⅰ核酸酶（货号：20200401）购自北京义翘神州科技有限公司，型号Ⅱ核酸酶（货号：K51661195）购自德国Merck公司；β-丙内酯购自德国SERVA公司；PBS由吉林惠康生物药业有限公司制备；狂犬病疫苗效力检定用国家标准品（批号：250009-201909）购自中国食品药品检定研究院；Benzonase^®ELISA Kit Ⅱ检测试剂盒（批号：K95766581）购自德国Merck公司；Vero残留DNA检测试剂盒（PCR-荧光探针法，货号：SK030204V100）和Vero细胞残余DNA片段分析检测试剂盒（货号：1103174）购自湖州申科生物技术有限公司。

清洁级小鼠504只，体质量12～14 g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，生产许可证号：SCXK（吉）2020-0002；无特定病原体级SD大鼠40只，雌雄各半，体质量160~180 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。动物实验使用的方法经动物伦理委员会批准，编号为XB-IACUC-0479。

日本大耳白兔4只，雌雄各半，体质量1.5~3.0 kg，购自青岛康大生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（鲁）2016-0002。动物实验使用的方法经动物伦理委员会批准，编号为XB-IACUC-0507。

1.2.1　狂犬病病毒液的制备采用生物反应器，将狂犬病病毒固定毒（aGV株）接种到微载体培养的Vero细胞培养液中，培养72 h，病毒滴度达到7.0 lg半数致死剂量/ml，收获病毒液，经澄清过滤、离子交换浓缩、0.02 mol/L PBS洗涤和置换，加入人血白蛋白及0.4 mol/L MgCl₂溶液，制得病毒浓缩液。病毒浓缩液经层析系统纯化后采用β-丙内酯灭活，制备成原液及成品。

1.2.2　核酸酶添加量与作用温度本研究固定2 h酶解时间，采用型号Ⅰ的核酸酶，分别在25和37 ℃两个酶解温度下向病毒浓缩液中加入核酸酶，按每毫升病毒液中分别添加0.15与0.30 U的核酸酶，分设为试验组1—4；采用型号Ⅱ的核酸酶，分别在25和37 ℃两个酶解温度下，按每毫升病毒液中分别添加0.15与0.30 U的核酸酶，设为试验组5—8。将所得8组样品分别在压力1.5×10⁵Pa下经分子筛层析，用0.02 mol/L PBS洗脱，收集波长280 nm处流出液，再经β-丙内酯灭活、水解2 h，加入人血白蛋白即得原液。

1.2.3　原液残余DNA检测及片段分析鉴于定量PCR法具有简单、快速、更加灵敏、能检测含量较低的残余DNA及定性分析残余DNA片段和分布等优点，依据中国药典2020年版（药典三部）通则3407定量PCR法（第三法）检查Vero细胞DNA残留。设计Vero细胞基因组DNA特异性引物（探针：5´FAM-CCTTCAAGAAGCCTTTCGCTAAG-T AMRA3´；正向引物：5´-GCTTTCTGAGAAACTGCTCTGTGT-3´；反向引物：5´-GGAAGATATTTCCTTTTTCACCATAGC-3´，获得3种不同的扩增片段（99、154、221 bp），定量检测分析已确定酶解温度和酶解浓度的3批原液中Vero细胞残留DNA片段的大小分布情况。

1.2.4　核酸酶残留量检测在利用核酸酶去除人用狂犬病疫苗中核酸杂质的过程中，核酸酶也将作为蛋白工艺杂质残留在产品中，采用药典三部通则3429酶联免疫检测方法对1.2.2项各试验组开展核酸酶残留量研究。对选定酶解温度和酶解浓度参数，开展3批原液核酸酶残留量检查。

将标准品按照试剂盒厂家说明书稀释至浓度为0.20、0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.50 ng/ml，将稀释后的标准品和供试品加入到96孔酶标板中，再加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体，待反应结束后洗涤，然后加入底物进行显色反应，并在终止液的作用下转变成最终的黄色，置于酶标仪450 nm波长处读取标准品的吸光度（A）值，以标准品的浓度为X轴和对应的A值为Y轴，做四参数拟合得到浓度与A值的标准曲线，将供试品的A值代入以上函数中，得出供试品所对应的浓度，即为供试品中核酸酶残留量。当供试品A值小于曲线0.20 ng/ml浓度对应的A值，结果判定为核酸酶残留量小于0.20 ng/ml；若供试品A值大于曲线中12.50 ng/ml浓度对应的A值，需将供试品做进一步稀释测定，使其测定值居0.20~12.50 ng/ml所对应的A值区间。

1.2.5　效价检测采用药典三部通则3503人用狂犬病疫苗效价测定法（第一法 NIH法），在小鼠中开展3批液体人用狂犬病疫苗效价检测，与未加核酸酶的人用狂犬病疫苗（Vero细胞）效价进行比对。

式中P为供试品效价，国际单位（international unit，IU）/ml；T为供试品有效中量的倒数；S为狂犬病疫苗效力检定用国家标准品有效中量的倒数；dT为供试品的1次人用剂量，ml；dS为狂犬病疫苗效力检定用国家标准品的1次人用剂量，ml；D为狂犬病疫苗效力检定用国家标准品的效价，IU/ml。

1.2.6　动物安全性试验依据《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》，采用1批人用狂犬病疫苗开展SD大鼠单次给药毒性试验和日本大耳白兔肌肉刺激性试验。

SD大鼠单次给药毒性试验：选用40只SD大鼠，雌雄各半，按性别和体质量随机分为阴性对照组和供试品组，每组10♀/10♂。采用肌内注射给药，给药体积为1.0 ml/只（四肢多点给药，前肢0.2 ml/点，后肢0.3 ml/点），阴性对照组给予0.9%氯化钠注射液，供试品组注射人用狂犬病疫苗（Vero细胞）。动物给药当日定点连续观察，其后每天上、下午各观察1次，连续观察14 d；给药前、后每周测定2次体质量，试验结束后大鼠体质量用Excel软件计算出均值、标准差，并计算体质量增长率：体质量增长率=（体质量﹣药前体质量）÷药前体质量×100%，以均值±标准差表示；死亡动物和试验结束后所有存活动物进行大体剖检，大体剖检病变器官进行组织病理学检查。

日本大耳白兔肌肉刺激性试验：取健康的日本大耳白兔4只，2♀/2♂。采用同体左右侧自身对照法。动物先以电推剪毛，暴露左右两侧股四头肌，在每只兔右、左两侧剪毛处分别经股四头肌注射人用狂犬病疫苗（Vero细胞）、同体积0.9%氯化钠注射液，给药容积1 ml/（侧·只），给药时间约30 s/侧，单次给药。分别于给药后48 h及继续恢复14d结束后各处死1/2动物（1♀/1♂），解剖取出股四头肌，纵向切开，肉眼观察注射部位肌肉组织的刺激反应状况，用10%中性福尔马林固定，进行组织病理学检查。

由结果可见，在相同的酶解温度、相同的酶解浓度，型号Ⅱ核酸酶比型号Ⅰ核酸酶条件下DNA残留量低；相同型号核酸酶、相同酶解浓度，37 ℃酶解温度比25 ℃酶解温度条件下DNA残留量低；相同型号核酸酶，相同酶解温度，0.30 U/ml酶解浓度比0.15 U/ml酶解浓度条件下DNA残留量低。2种型号核酸酶在不同酶解温度、不同酶解浓度下DNA残留量趋势见图1。

原液的残余宿主细胞DNA均小于2 ng/剂，符合药典三部的要求。3批原液中大于221 bp片段占总DNA残留量的比例均未超过25%，DNA片段分布的中位数所在区间小于221 bp，结果见表1。

核酸酶筛选时酶解浓度为0.30 U/ml的核酸酶残留量均大于试剂盒的检测下限0.20 ng/ml，酶解浓度为0.15 U/ml的核酸酶残留量均小于试剂盒的检测下限0.20 ng/ml。

3批液体人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液核酸酶残留量检测中曲线方程决定系数≥0.97，试验成立，残留量均低于试剂盒检测下限，即结果均小于0.20 ng/ml。核酸酶残留量检测曲线见图2。

3批液体人用狂犬病疫苗（Vero细胞）添加核酸酶，效价结果分别为6.3、6.4、6.4 IU/剂，均值为6.4 IU/剂，高于未加核酸酶的人用狂犬病疫苗（Vero细胞）效价历史均值5.5 IU/剂。其稳定性数据在22个月内呈逐渐下降趋势，最小值为2.8 IU/剂，符合标准要求。效价稳定性考察趋势见图3。

2.5.1　SD大鼠单次给药毒性试验试验期间无动物死亡，给药后阴性对照与供试品组动物的一般状态及局部症状未见异常；供试品组与阴性对照组动物体质量增长一致，未见异常；试验结束后，所有存活动物进行大体检查，组织脏器未见病理改变。雄性、雌性SD大鼠体质量和增长率分别见表2、表3。

2.5.2　日本大耳白兔刺激性试验给药后动物状态良好，未出现死亡；肉眼观察给药局部未见异常。给药后48 h剖检，肉眼观察所有动物给药侧及对照侧均无红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应；继续恢复14 d剖检，肉眼观察所有动物对照侧和给药侧均无红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应，镜检结果未见组织病理学和病理学改变。大体剖检组织病理学检查结果：给药后48 h，所有动物对照侧及给药侧均未见药物相关组织病理学改变；继续恢复14 d，所有动物对照侧及给药侧均未见药物相关组织病理学改变。组织病理学检查结果：给药后48 h和恢复期结束，所有动物右侧（给药侧）股四头肌注射部位均未见明显药物引起的刺激性组织病理学改变，股四头肌注射部位组织病理学图片见图4。

DNA残留量检验采用每批原液3个重复孔即3组数据，3批原液共9组数据，F=170 072.29，P=0.344，差异无统计学意义，数据均在x̅±3s范围内，符合正态分布。单值控制图见图5。

利用核酸酶去除多种病毒性疫苗中的Vero细胞DNA已被广泛应用于制药和生物工程产业的各个环节，如美国百特国际有限公司采用Vero细胞生产甲型流感疫苗中，利用核酸酶去除DNA；美国默沙东公司生产的甲型肝炎疫苗裂解后加入核酸内切酶降解DNA，提高甲型肝炎疫苗的收率。

本研究中不同型号的核酸酶对液体人用狂犬病疫苗（Vero细胞）DNA降解无明显差异；虽然在相同酶解浓度时，高酶解温度（37 ℃）比低酶解温度（25 ℃）条件下DNA残留量低；在相同酶解温度时，高酶解浓度（0.30 U/ml）比低酶解浓度（0.15 U/ml）条件下DNA残留量低，但均符合药典三部不高于2 ng/剂的标准要求。由于狂犬病病毒对温度的抵抗力很弱，较高的酶作用温度可能会影响狂犬病病毒的表面抗原，因此在降低Vero细胞DNA残留量的同时应充分保护抗原活性，考虑到25 和37 ℃作用温度下DNA残留量无显著差异，同时25 ℃可以节约能源，选择25 ℃作为核酸酶作用温度；作为工艺杂质的核酸酶在酶解浓度0.30 U/ml时其残留量高于检测下限，考虑到纯化工艺的选择应兼顾抗原纯度、活性、残留物限度等因素，以获得最适的收获物和最少的工艺杂质为目标，选择0.15 U/ml作为核酸酶作用浓度。综上，本研究的最终参数选择25 ℃酶解温度和0.15 U/ml酶解浓度。

FDA认为将宿主DNA片段控制在200 bp以下，可基本控制风险。有文献报道，当DNA片段大小的中位数低于350 bp时，感染性会低于检测下限。本研究中采用0.15 U/ml酶解浓度和25 ℃酶解温度筛选参数生产3批原液的残余宿主细胞DNA分别为0.77、0.20、0.45 ng/剂，均小于2 ng/剂，符合药典三部的要求；同时对DNA片段大小进行了控制，大于221 bp片段占总DNA残留量的比例分别为15.16%、21.74%、24.23%，均未超过25%，DNA片段分布的中位数所在区间均小于221 bp。

疫苗的效价是使人体产生特异性免疫力的能力，也是保证疫苗中有效物质的重要指标，国内外人用狂犬病疫苗效价测定均采用NIH效价试验方法，是衡量疫苗有效性的金标准。添加核酸酶的液体人用狂犬病疫苗（Vero细胞）效价均值6.4 IU/剂，与未加核酸酶的人用狂犬病疫苗（Vero细胞）效价历史均值（5.5 IU/剂）相比，免疫原性更优。

大鼠单次肌内注射添加核酸酶的人用狂犬病疫苗（Vero细胞）后，动物一般状态观察、局部症状、体质量及大体剖检未见明显异常；日本大耳白兔按临床剂量单次肌内注射添加核酸酶的人用狂犬病疫苗（Vero细胞）未见药物相关刺激性，组织病理学检查股四头肌注射部位未见明显药物引起的刺激性组织病理学改变。

综上所述，本研究筛选到合适的酶解温度（25 ℃）和酶解浓度（0.15 U/ml），可将Vero细胞的DNA水解成较小的片段，降低Vero细胞DNA残留量，达到原液的残留宿主细胞DNA小于2 ng/剂限定标准，核酸酶残留量低于检测下限0.2 ng/ml，免疫原性也优于未添加核酸产品。有文献报道，在病毒灭活过程中，β-丙内酯可与疫苗生产过程中作为疫苗稳定剂的人血白蛋白结合产生变性复合物，使疫苗接种者产生抗人血白蛋白IgE，多次免疫或加强免疫时可能引起人体过敏反应。本研究在添加核酸酶筛选时采用先纯化尽可能先除去人血清白蛋白后灭活操作，从而降低由于灭活引起致敏性的风险。大鼠的毒性反应和家兔刺激性实验进一步论证了添加核酸酶疫苗的安全性。本研究为液体人用狂犬病疫苗（Vero细胞）研发的临床安全应用奠定了理论依据。

张海平¹曾智²周慧明²刘宝峰³张怡轩¹石亮⁴

¹沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，沈阳 110016；²吉林惠康生物药业有限公司原液车间，长春 130012；³山东欣博药物安全评价研究中心，德州 251500；⁴长春百克生物科技股份公司，长春 130015

通信作者：

张怡轩，Email：zhangyxzsh@163.com；

石亮，Email：shiliang@bchtpharm.com

引用本文：张海平, 曾智, 周慧明, 等. 核酸酶在人用狂犬病疫苗（Vero细胞）生产中的筛选及安全性评价[J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(6): 371-377.  

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240530-00037

目的   在生产以Vero细胞为基质的液体人用狂犬病疫苗过程中，添加不同厂家的核酸酶，筛选合适的核酸酶处理条件，评价该条件下液体人用狂犬病疫苗的安全性。

方法   温度25 ℃、37 ℃下，向病毒液中加入酶解浓度为0.15、0.30 U/ml的核酸酶，经层析系统纯化后采用β-丙内酯灭活，制备成原液及成品。采用PCR法和ELISA分别检测原液DNA残留量和核酸酶残留量，筛选出酶解温度和酶解浓度；采用PCR法分析原液中Vero细胞残留DNA片段和检测残留量；通过NIH法检测成品的效价来评价免疫原性，开展SD大鼠单次给药毒性试验和大耳白兔肌肉刺激性试验评价产品安全性。

结果   筛选酶解浓度为0.15 U/ml，酶解温度为25 ℃；残留DNA符合中国药典2020年版要求，核酸酶残留量在试剂盒检测下限0.2 ng/ml以下；残留DNA大于221 bp片段占DNA总残留量的比例少于25%；大鼠毒性试验和大耳白兔给药后未见异常，组织病理学检查均未见病理学改变。

结论   筛选到合适的酶解温度和酶解浓度，可将Vero细胞的DNA酶解成较小的片段，降低Vero细胞DNA残留量；动物安全性试验评价安全可靠，为Vero细胞基质疫苗的研发与应用奠定理论依据。

Vero细胞作为经WHO批准的可用于人类疫苗生产的病毒培养基质，现已广泛应用于脊髓灰质炎灭活疫苗、口服轮状病毒疫苗、流感疫苗、乙型脑炎灭活疫苗和甲型肝炎灭活疫苗中。目前在中国境内生产上市的人用狂犬病疫苗使用的细胞基质主要为Vero细胞、人二倍体细胞和原代地鼠肾细胞。Vero细胞作为疫苗生产用连续传代细胞基质，其残留DNA是疫苗中的杂质，应尽量减少。疫苗中的宿主细胞DNA残留具有潜在的致瘤性，其致瘤的主要机制是显性癌基因（如myc、ras等）的诱导表达，DNA片段越小，其包含癌基因和其他功能序列的可能性就越小，去除残留DNA可降低具有编码活性DNA的潜在致瘤风险。故需对DNA残留需进行严格的质量控制，以提高制品的安全性。

核酸酶是来源于黏质沙雷菌、经基因工程改进的、多功能非动物源性内切核酸酶，可将不同的DNA或RNA链完全水解成小片段，且无蛋白水解活性，可在不破坏病毒蛋白衣壳的同时，将外部核酸杂质完全水解。本研究拟通过添加不同厂家来源、不同添加量的核酸酶，在不同作用温度下对狂犬病病毒液进行处理，筛选出合适的参数，达到将Vero细胞DNA水解为小片段、降低宿主细胞DNA残留量的目的。病毒液经层析系统纯化后采用β-丙内酯灭活，制备成原液及成品。再对确定参数生产出的产品开展动物安全性评价，为Vero细胞基质疫苗的研发和临床安全应用奠定理论依据。有文献报道，病毒液超滤时体积可浓缩1到100倍，而核酸酶在浓缩液中使用终浓度一般为1~50 U/ml。本研究将病毒液超滤浓缩50倍，按每毫升病毒液设计加入核酸酶0.15和0.30 U开展试验，符合使用终浓度的要求。

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Vero细胞（来源于原中国药品生物制品检定所，传代至134代制成工作细胞库）、狂犬病病毒固定毒aGV株（来源于原中国药品生物制品检定所，传代至14代制成工作种子批）均由吉林惠康生物药业有限公司保存；人用狂犬病疫苗（批号：S202010003，规格1.0 ml/瓶）采用Vero细胞接种微载体的生物反应器技术制备，由吉林惠康生物药业有限公司提供。

型号Ⅰ核酸酶（货号：20200401）购自北京义翘神州科技有限公司，型号Ⅱ核酸酶（货号：K51661195）购自德国Merck公司；β-丙内酯购自德国SERVA公司；PBS由吉林惠康生物药业有限公司制备；狂犬病疫苗效力检定用国家标准品（批号：250009-201909）购自中国食品药品检定研究院；Benzonase^®ELISA Kit Ⅱ检测试剂盒（批号：K95766581）购自德国Merck公司；Vero残留DNA检测试剂盒（PCR-荧光探针法，货号：SK030204V100）和Vero细胞残余DNA片段分析检测试剂盒（货号：1103174）购自湖州申科生物技术有限公司。

清洁级小鼠504只，体质量12～14 g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，生产许可证号：SCXK（吉）2020-0002；无特定病原体级SD大鼠40只，雌雄各半，体质量160~180 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。动物实验使用的方法经动物伦理委员会批准，编号为XB-IACUC-0479。

日本大耳白兔4只，雌雄各半，体质量1.5~3.0 kg，购自青岛康大生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（鲁）2016-0002。动物实验使用的方法经动物伦理委员会批准，编号为XB-IACUC-0507。

1.2.1　狂犬病病毒液的制备采用生物反应器，将狂犬病病毒固定毒（aGV株）接种到微载体培养的Vero细胞培养液中，培养72 h，病毒滴度达到7.0 lg半数致死剂量/ml，收获病毒液，经澄清过滤、离子交换浓缩、0.02 mol/L PBS洗涤和置换，加入人血白蛋白及0.4 mol/L MgCl₂溶液，制得病毒浓缩液。病毒浓缩液经层析系统纯化后采用β-丙内酯灭活，制备成原液及成品。

1.2.2　核酸酶添加量与作用温度本研究固定2 h酶解时间，采用型号Ⅰ的核酸酶，分别在25和37 ℃两个酶解温度下向病毒浓缩液中加入核酸酶，按每毫升病毒液中分别添加0.15与0.30 U的核酸酶，分设为试验组1—4；采用型号Ⅱ的核酸酶，分别在25和37 ℃两个酶解温度下，按每毫升病毒液中分别添加0.15与0.30 U的核酸酶，设为试验组5—8。将所得8组样品分别在压力1.5×10⁵Pa下经分子筛层析，用0.02 mol/L PBS洗脱，收集波长280 nm处流出液，再经β-丙内酯灭活、水解2 h，加入人血白蛋白即得原液。

1.2.3　原液残余DNA检测及片段分析鉴于定量PCR法具有简单、快速、更加灵敏、能检测含量较低的残余DNA及定性分析残余DNA片段和分布等优点，依据中国药典2020年版（药典三部）通则3407定量PCR法（第三法）检查Vero细胞DNA残留。设计Vero细胞基因组DNA特异性引物（探针：5´FAM-CCTTCAAGAAGCCTTTCGCTAAG-T AMRA3´；正向引物：5´-GCTTTCTGAGAAACTGCTCTGTGT-3´；反向引物：5´-GGAAGATATTTCCTTTTTCACCATAGC-3´，获得3种不同的扩增片段（99、154、221 bp），定量检测分析已确定酶解温度和酶解浓度的3批原液中Vero细胞残留DNA片段的大小分布情况。

1.2.4　核酸酶残留量检测在利用核酸酶去除人用狂犬病疫苗中核酸杂质的过程中，核酸酶也将作为蛋白工艺杂质残留在产品中，采用药典三部通则3429酶联免疫检测方法对1.2.2项各试验组开展核酸酶残留量研究。对选定酶解温度和酶解浓度参数，开展3批原液核酸酶残留量检查。

将标准品按照试剂盒厂家说明书稀释至浓度为0.20、0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.50 ng/ml，将稀释后的标准品和供试品加入到96孔酶标板中，再加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体，待反应结束后洗涤，然后加入底物进行显色反应，并在终止液的作用下转变成最终的黄色，置于酶标仪450 nm波长处读取标准品的吸光度（A）值，以标准品的浓度为X轴和对应的A值为Y轴，做四参数拟合得到浓度与A值的标准曲线，将供试品的A值代入以上函数中，得出供试品所对应的浓度，即为供试品中核酸酶残留量。当供试品A值小于曲线0.20 ng/ml浓度对应的A值，结果判定为核酸酶残留量小于0.20 ng/ml；若供试品A值大于曲线中12.50 ng/ml浓度对应的A值，需将供试品做进一步稀释测定，使其测定值居0.20~12.50 ng/ml所对应的A值区间。

1.2.5　效价检测采用药典三部通则3503人用狂犬病疫苗效价测定法（第一法 NIH法），在小鼠中开展3批液体人用狂犬病疫苗效价检测，与未加核酸酶的人用狂犬病疫苗（Vero细胞）效价进行比对。

式中P为供试品效价，国际单位（international unit，IU）/ml；T为供试品有效中量的倒数；S为狂犬病疫苗效力检定用国家标准品有效中量的倒数；dT为供试品的1次人用剂量，ml；dS为狂犬病疫苗效力检定用国家标准品的1次人用剂量，ml；D为狂犬病疫苗效力检定用国家标准品的效价，IU/ml。

1.2.6　动物安全性试验依据《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》，采用1批人用狂犬病疫苗开展SD大鼠单次给药毒性试验和日本大耳白兔肌肉刺激性试验。

SD大鼠单次给药毒性试验：选用40只SD大鼠，雌雄各半，按性别和体质量随机分为阴性对照组和供试品组，每组10♀/10♂。采用肌内注射给药，给药体积为1.0 ml/只（四肢多点给药，前肢0.2 ml/点，后肢0.3 ml/点），阴性对照组给予0.9%氯化钠注射液，供试品组注射人用狂犬病疫苗（Vero细胞）。动物给药当日定点连续观察，其后每天上、下午各观察1次，连续观察14 d；给药前、后每周测定2次体质量，试验结束后大鼠体质量用Excel软件计算出均值、标准差，并计算体质量增长率：体质量增长率=（体质量﹣药前体质量）÷药前体质量×100%，以均值±标准差表示；死亡动物和试验结束后所有存活动物进行大体剖检，大体剖检病变器官进行组织病理学检查。

日本大耳白兔肌肉刺激性试验：取健康的日本大耳白兔4只，2♀/2♂。采用同体左右侧自身对照法。动物先以电推剪毛，暴露左右两侧股四头肌，在每只兔右、左两侧剪毛处分别经股四头肌注射人用狂犬病疫苗（Vero细胞）、同体积0.9%氯化钠注射液，给药容积1 ml/（侧·只），给药时间约30 s/侧，单次给药。分别于给药后48 h及继续恢复14d结束后各处死1/2动物（1♀/1♂），解剖取出股四头肌，纵向切开，肉眼观察注射部位肌肉组织的刺激反应状况，用10%中性福尔马林固定，进行组织病理学检查。

由结果可见，在相同的酶解温度、相同的酶解浓度，型号Ⅱ核酸酶比型号Ⅰ核酸酶条件下DNA残留量低；相同型号核酸酶、相同酶解浓度，37 ℃酶解温度比25 ℃酶解温度条件下DNA残留量低；相同型号核酸酶，相同酶解温度，0.30 U/ml酶解浓度比0.15 U/ml酶解浓度条件下DNA残留量低。2种型号核酸酶在不同酶解温度、不同酶解浓度下DNA残留量趋势见图1。

原液的残余宿主细胞DNA均小于2 ng/剂，符合药典三部的要求。3批原液中大于221 bp片段占总DNA残留量的比例均未超过25%，DNA片段分布的中位数所在区间小于221 bp，结果见表1。

核酸酶筛选时酶解浓度为0.30 U/ml的核酸酶残留量均大于试剂盒的检测下限0.20 ng/ml，酶解浓度为0.15 U/ml的核酸酶残留量均小于试剂盒的检测下限0.20 ng/ml。

3批液体人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液核酸酶残留量检测中曲线方程决定系数≥0.97，试验成立，残留量均低于试剂盒检测下限，即结果均小于0.20 ng/ml。核酸酶残留量检测曲线见图2。

3批液体人用狂犬病疫苗（Vero细胞）添加核酸酶，效价结果分别为6.3、6.4、6.4 IU/剂，均值为6.4 IU/剂，高于未加核酸酶的人用狂犬病疫苗（Vero细胞）效价历史均值5.5 IU/剂。其稳定性数据在22个月内呈逐渐下降趋势，最小值为2.8 IU/剂，符合标准要求。效价稳定性考察趋势见图3。

2.5.1　SD大鼠单次给药毒性试验试验期间无动物死亡，给药后阴性对照与供试品组动物的一般状态及局部症状未见异常；供试品组与阴性对照组动物体质量增长一致，未见异常；试验结束后，所有存活动物进行大体检查，组织脏器未见病理改变。雄性、雌性SD大鼠体质量和增长率分别见表2、表3。

2.5.2　日本大耳白兔刺激性试验给药后动物状态良好，未出现死亡；肉眼观察给药局部未见异常。给药后48 h剖检，肉眼观察所有动物给药侧及对照侧均无红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应；继续恢复14 d剖检，肉眼观察所有动物对照侧和给药侧均无红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应，镜检结果未见组织病理学和病理学改变。大体剖检组织病理学检查结果：给药后48 h，所有动物对照侧及给药侧均未见药物相关组织病理学改变；继续恢复14 d，所有动物对照侧及给药侧均未见药物相关组织病理学改变。组织病理学检查结果：给药后48 h和恢复期结束，所有动物右侧（给药侧）股四头肌注射部位均未见明显药物引起的刺激性组织病理学改变，股四头肌注射部位组织病理学图片见图4。

DNA残留量检验采用每批原液3个重复孔即3组数据，3批原液共9组数据，F=170 072.29，P=0.344，差异无统计学意义，数据均在x̅±3s范围内，符合正态分布。单值控制图见图5。

利用核酸酶去除多种病毒性疫苗中的Vero细胞DNA已被广泛应用于制药和生物工程产业的各个环节，如美国百特国际有限公司采用Vero细胞生产甲型流感疫苗中，利用核酸酶去除DNA；美国默沙东公司生产的甲型肝炎疫苗裂解后加入核酸内切酶降解DNA，提高甲型肝炎疫苗的收率。

本研究中不同型号的核酸酶对液体人用狂犬病疫苗（Vero细胞）DNA降解无明显差异；虽然在相同酶解浓度时，高酶解温度（37 ℃）比低酶解温度（25 ℃）条件下DNA残留量低；在相同酶解温度时，高酶解浓度（0.30 U/ml）比低酶解浓度（0.15 U/ml）条件下DNA残留量低，但均符合药典三部不高于2 ng/剂的标准要求。由于狂犬病病毒对温度的抵抗力很弱，较高的酶作用温度可能会影响狂犬病病毒的表面抗原，因此在降低Vero细胞DNA残留量的同时应充分保护抗原活性，考虑到25 和37 ℃作用温度下DNA残留量无显著差异，同时25 ℃可以节约能源，选择25 ℃作为核酸酶作用温度；作为工艺杂质的核酸酶在酶解浓度0.30 U/ml时其残留量高于检测下限，考虑到纯化工艺的选择应兼顾抗原纯度、活性、残留物限度等因素，以获得最适的收获物和最少的工艺杂质为目标，选择0.15 U/ml作为核酸酶作用浓度。综上，本研究的最终参数选择25 ℃酶解温度和0.15 U/ml酶解浓度。

FDA认为将宿主DNA片段控制在200 bp以下，可基本控制风险。有文献报道，当DNA片段大小的中位数低于350 bp时，感染性会低于检测下限。本研究中采用0.15 U/ml酶解浓度和25 ℃酶解温度筛选参数生产3批原液的残余宿主细胞DNA分别为0.77、0.20、0.45 ng/剂，均小于2 ng/剂，符合药典三部的要求；同时对DNA片段大小进行了控制，大于221 bp片段占总DNA残留量的比例分别为15.16%、21.74%、24.23%，均未超过25%，DNA片段分布的中位数所在区间均小于221 bp。

疫苗的效价是使人体产生特异性免疫力的能力，也是保证疫苗中有效物质的重要指标，国内外人用狂犬病疫苗效价测定均采用NIH效价试验方法，是衡量疫苗有效性的金标准。添加核酸酶的液体人用狂犬病疫苗（Vero细胞）效价均值6.4 IU/剂，与未加核酸酶的人用狂犬病疫苗（Vero细胞）效价历史均值（5.5 IU/剂）相比，免疫原性更优。

大鼠单次肌内注射添加核酸酶的人用狂犬病疫苗（Vero细胞）后，动物一般状态观察、局部症状、体质量及大体剖检未见明显异常；日本大耳白兔按临床剂量单次肌内注射添加核酸酶的人用狂犬病疫苗（Vero细胞）未见药物相关刺激性，组织病理学检查股四头肌注射部位未见明显药物引起的刺激性组织病理学改变。

综上所述，本研究筛选到合适的酶解温度（25 ℃）和酶解浓度（0.15 U/ml），可将Vero细胞的DNA水解成较小的片段，降低Vero细胞DNA残留量，达到原液的残留宿主细胞DNA小于2 ng/剂限定标准，核酸酶残留量低于检测下限0.2 ng/ml，免疫原性也优于未添加核酸产品。有文献报道，在病毒灭活过程中，β-丙内酯可与疫苗生产过程中作为疫苗稳定剂的人血白蛋白结合产生变性复合物，使疫苗接种者产生抗人血白蛋白IgE，多次免疫或加强免疫时可能引起人体过敏反应。本研究在添加核酸酶筛选时采用先纯化尽可能先除去人血清白蛋白后灭活操作，从而降低由于灭活引起致敏性的风险。大鼠的毒性反应和家兔刺激性实验进一步论证了添加核酸酶疫苗的安全性。本研究为液体人用狂犬病疫苗（Vero细胞）研发的临床安全应用奠定了理论依据。

张海平¹曾智²周慧明²刘宝峰³张怡轩¹石亮⁴

¹沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，沈阳 110016；²吉林惠康生物药业有限公司原液车间，长春 130012；³山东欣博药物安全评价研究中心，德州 251500；⁴长春百克生物科技股份公司，长春 130015

通信作者：

张怡轩，Email：zhangyxzsh@163.com；

石亮，Email：shiliang@bchtpharm.com

引用本文：张海平, 曾智, 周慧明, 等. 核酸酶在人用狂犬病疫苗（Vero细胞）生产中的筛选及安全性评价[J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(6): 371-377.  

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240530-00037